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慢性髓系白血病患者CD34+CD38-细胞水平JunB和CDH13基因启动子区域的甲基化状态研究
慢性髓系白血病(CML)是骨髓造血干细胞恶性增殖的克隆性疾病,在CML患者细胞水平由于JunB和CDH13基因启动子区甲基化而使这2个抑癌基因的表达受损.为了探讨正常人和CML患者CD34+CD38-细胞水平JunB和CDH13(cadherin-13)基因启动子区域甲基化状态及表达水平的差异,应用流式细胞仪分选出CD34+CD38-细胞,采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测5例正常人和8例CML患者骨髓CD34+CD38-细胞JunB和CDH13基因启动子区域甲基化状态,用实时定量PCR(RT-PCR)检测JunB和CDH13基因的表达情况.结果表明:JUNB和CDH13基因在正常人骨髓CD34+CD38-细胞中呈完全性非甲基化状态,CML患者骨髓CD34+CD38-细胞中JunB和CDH13基因启动子区甲基化比例分别为87.5%(7/8)和50%(4/8),明显高于正常人(P＜0.05).CML患者骨髓CD34+CD38-细胞中JunB和CDH13基因mRNA相对表达水平与正常人的相比明显降低(2-△CT 分别为1/5.21和1/10.63).结论:在CML患者骨髓CD34+CD38-细胞中JunB和CDH13基因启动子区域都发生了高度的甲基化,它们的mRNA表达水平也明显降低,JunB和CDH13基因启动子区域甲基化在CML的发病机制中起到一定的作用,甲基化检测对CML的靶向治疗及新的治疗方法具有重要意义.
关键词： JunB CDH13 DNA甲基化 慢性髓系白血病 CD34+CD38-细胞 -
microRNA在人脐血CD34+CD38-、CD34+CD38+细胞中的差异性表达
为进一步探讨microRNA(miRNA)在造血调控中的作用奠定基础,比较了miRNA在人脐血CD34+CD38-、CD34+CD38+细胞中的差异性表达.从人脐血中分离单个核细胞(MNC),应用FACSVantage分选流式细胞仪分选CD34+CD38-、CD34+CD38+细胞;抽提miRNA后与miRNA芯片杂交,应用生物信息学技术分析miRNA芯片的表达结果.结果发现,miRNA在人脐血CD34+CD38+细胞的表达水平比在CD34+CD38-细胞的表达水平降低至1/2以下者共11个,表达水平升高至2倍以上者共73个,以上84个miRNA被称为"干细胞性"miRNA.经比较Georgantas等和芯片表达结果,发现有12个(14.29%,12/84)相同的miRNA.部分miRNA经历了类似于CD34在造血细胞表面的发展历程.应用生物信息学技术可寻找到新的与造血调控相关的miRNA簇及miRNA的下游靶基因.结论:"干细胞性"miRNA在正常造血中发挥着重要作用,即miRNA的系统表达模式→造血干/祖细胞基因表达谱→造血干/祖细胞的自我更新和系列定向分化.
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脐血CD34+CD38-早期造血祖细胞的体外增殖和凋亡
为了从适龄产妇脐血中分离出CD34+CD38-细胞,在体外较长时间培养后观察分析CD34+CD38-细胞分裂增殖、凋亡以及干细胞因子对CD34+CD38-细胞增殖的影响,用流式细胞仪从10例健康产妇脐血中分选出CD34+和CD38-标记的脐血原始细胞,在添加IL-3、IL-6、GM-CSF、EPO、IGF-1和SCF 6种混合因子的干细胞培养基中培养6个月,观察细胞并绘制生长曲线,用单细胞凝胶电泳检测干细胞因子对CD34+CD38-细胞生长的影响和用流式细胞仪检测CD34+CD38-细胞凋亡情况.结果表明:脐血CD34+CD38-细胞可在体外较长时间培养增殖,无异常或过度的细胞凋亡发生.结论:通过控制培养条件,脐血CD34+CD38-早期造血祖细胞可在体外较长时间培养增殖,以作为大量脐血原始细胞移植的细胞来源.
关键词： 脐血 CD34+CD38-细胞 体外增殖 -
当归多糖诱导人白血病干细胞衰老与调控端粒系统机制的研究
目的 探讨当归多糖(ASP)调控人CD34+CD38-骨髓白血病干细胞(LSC)衰老的端粒与端粒酶机制.方法 免疫磁性分选人骨髓CD34+CD38 LSC; CCK-8检测ASP对CD34+CD38-LSC增殖抑制能力;衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测细胞衰老情况;混合集落培养(CFU-Mix)检测细胞增殖能力;荧光定量RT-PCR检测端粒酶基因TERT变化;TRAP-PCR检测细胞端粒酶活性;Southern blotting检测细胞端粒长度变化.结果 免疫磁性分选后人骨髓CD34+CD38-LSC纯度达(91.15±2.41)％,相差显微镜观察显示细胞形态饱满,透明度高,折光性强.ASP体外诱导CD34+CD38-LSC 48 h,能有效抑制其增殖且呈浓度依赖性(P＜0.05),集落形成能力下降(P＜0.01).40 μg/mL ASP作用CD34+CD38-LSC 48 h,SA-β-Gal染色阳性细胞率明显升高(P＜0.01); CD34+CD38-LSC端粒酶基因TERT表达水平下降(P＜0.05);端粒酶活性下降(P＜0.05);端粒长度缩短(P＜0.05).结论 ASP在体外可能通过调控细胞端粒系统诱导人骨髓CD34+CD38-LSC衰老.
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Hes1对急性髓系白血病患者骨髓CD34+CD38-细胞的作用及其机制研究
目的：研究Hes1对急性髓系白血病（AML）患者骨髓CD34+CD38-细胞的作用及其机制。方法：收集初治AML患者及正常供者骨髓样本后，通过密度梯度离心法获取单个核细胞，流式细胞术检测CD34+CD38-细胞比例及其细胞周期。通过免疫磁珠法分选CD34+CD38-细胞后，体外集落形成实验（CFC）检测其增殖能力，并通过Realtime PCR检测其Hes1的表达量。构建Hes1过表达逆转录病毒载体，感染正常供者骨髓CD34+细胞后，流式细胞术分析其细胞周期的改变，CFC检测其增殖的改变。结果：AML患者骨髓CD34+CD38-细胞比例明显低于正常对照，流式细胞术结果显示患者来源CD34+CD38-细胞大多数进入静止期，CFC结果显示患者CD34+CD38-细胞体外扩增能力下降。Realtime PCR结果发现患者CD34+CD38-细胞中Hes1表达上调。提高正常供者CD34+细胞中Hes1的表达后，细胞增殖减少，进入静止期。结论：在AML中CD34+CD38-细胞比例下降，进入静止期，与Hes1的表达上调有关。
关键词： AML白血病 CD34+CD38-细胞 HES1 细胞周期 增殖 -
免疫磁珠分选白血病KG1a细胞中CD34+CD38-干细胞及其特性研究
目的 从白血病KGla细胞中分选CD34+ CD38-干细胞并研究其生物学特性.方法 免疫磁珠法分选CD34+ CD38-细胞,流式细胞术分析细胞表面膜抗原、细胞周期,甲基纤维素培养体系观察其克隆性；以HL60、K562、CD34+ CD38+细胞为对照,甲基偶氮唑蓝法检测柔红霉素对CD34+ CD38-细胞的抑制作用；BALB/c裸鼠皮下接种,观察体内成瘤能力.结果 分选的CD34+ CD38-细胞纯度达95％以上,(69.03 +3.25)％处于Go期,克隆形成率为(38.64±2.68)％,明显抵抗柔红霉素；不同浓度柔红霉素作用后,CD34+ CD38-、CD34+ CD38+、HL60、K562细胞的活性差异有统计学意义(F =961.136,P=0.000)；CD34+ CD38-在裸鼠皮下成瘤率显著高于CD34+ CD38+细胞(P＜0.05).结论 免疫磁珠法分选白血病干细胞简单易行,分选的细胞符合白血病干细胞生物学特性.
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流式细胞检测术分析胎肝CD34+细胞成分
目的了解胎肝中CD34+CD38+和CD34+CD38-细胞数量组成.方法从胎肝中分离细胞,制成细胞悬液;经淋巴细胞分离液密度梯度离心,收集单个核细胞;洗涤两次,制备细胞母液;取约1×106细胞经CD34CD38荧光抗体标记,流式细胞仪检测CD34+CD38+和CD34+CD38-细胞含量;用红细胞裂解液裂解残留在MNCs中的红细胞,统计肝细胞中MNCs的相对总数,终统计出胎肝中CD34+和CD34+CD38-细胞的相对数量.结果 22～30W胎龄胎肝MNC中CD34+细胞平均为12.02%±4.00%,CD34+CD38-细胞平均为6.17%±5.08%,CD34+CD38-细胞在CD34+细胞中约占51.00%±32.56%;该期胎肝组织中CD34+细胞和CD34+CD38-细胞相对总数和胎龄有一定的相关性,30W时明显高于22W.结论 22～30W胎龄胎肝中的CD34+细胞和CD34+CD38-细胞相对百分率都高于胎儿脐血、新生儿脐血、成人骨髓和外周血的百分率;CD34+CD38-细胞在CD34+细胞中的比例也远高于上述四种组织中的比例.
