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沙眼衣原体pORF5质粒蛋白对HeLa细胞自噬的影响
目的 探讨沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)质粒蛋白pORF5对HeLa细胞自噬的影响,为进一步阐明Ct致病机制提供实验依据. 方法 PCR扩增Ct pORF5质粒蛋白基因,克隆入PLenO-DCE慢病毒质粒,构建慢病毒重组表达载体.慢病毒重组表达载体经双酶切及测序鉴定后与辅助质粒共转染293T细胞,制备慢病毒.收集慢病毒,再感染HeLa细胞,流式细胞仪分选获得pORF5基因稳定转染细胞株(PLenO-DCE/pORF5-HeLa).实验同时建立对照细胞株(PLenO-DCE-HeLa).血清饥饿处理两组细胞24 h,Real time PCR和Western blot检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Becin1的蛋白和mRNA表达水平,计算LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ比率;采用间接免疫荧光检测自噬荧光斑点. 结果 PLenO-DCE/pORF5-HeLa和PLenO-DCE-HeLa细胞饥饿处理后均出现LC3红色荧光斑点,斑点数分别为(97.6±12.1)个/细胞和(34.0±2.6)个/细胞,差异有统计学意义(t=45.36;P＜0.05);饥饿处理后PLenO-DCE-HeLa和PLenO-DCE/pORF5-HeLa细胞中LC3、Beclin1的mRNA表达水平均显著高于未处理组,其中PLenO-DCE/pORFS-HeLa细胞中LC3、Beclin1 mRNA的表达水平较未处理组增加3.10倍(t=95.25;P＜0.01)和0.85倍(t=16.56;P＜0.05),较PLenO-DCE-HeLa细胞分别增加1.95倍(t=79.12;P＜0.01)和1.57倍(t=23.95;P＜0.05);PLenO-DCE/pORF5-HeLa经饥饿处理24 h后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率和Beelin1蛋白较未处理组分别增加52.17％和76.00％(t值分别是15.13,57.24;P均＜0.05),较PLenO-DCE-HeLa细胞组分别增加1.05倍(t=35.21;P＜0.05)和4.34倍(t=112.23;P＜0.01). 结论 pORF5质粒蛋白可诱导HeLa细胞自噬,可能在Ct致病过程中发挥重要作用.
关键词： 沙眼衣原体 pORF5质粒蛋白 细胞自噬 微管相关蛋白1轻链3 Beclin1 -
沙眼衣原体pORF5质粒蛋白激活p38MAPK和NALP3信号通路调控THP-1细胞IL-1β分泌的研究
目的 研究沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)pORF5质粒蛋白诱导THP-1细胞产生IL-1β的分子机制,为阐明Ct致病机制提供实验依据. 方法 将原核表达重组体pGEX-6p/pORF5转化大肠埃希菌,表达并纯化GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白经蛋白酶酶切后制备不含GST标签的pORF5蛋白;用不同浓度的pORF5蛋白体外刺激THP-1细胞,ELISA测定不同时间IL-1β水平;分别用NALP3 siRNA、ASC siRNA、Caspase-1抑制剂和p38抑制剂预处理THP-1细胞,再用pORF5蛋白刺激THP-1细胞24 h,ELISA测定IL-1β含量,Real-time PCR测定IL-1β和NALP3炎性体mRNA的表达,Western blot分析Caspase-1的表达及p38磷酸化水平. 结果 pORF5蛋白以剂量和时间依赖的方式刺激THP-1细胞产生IL-1β,24 μg/ml pORF5蛋白刺激24 h时IL-1β的表达水平达到峰值(495.1±55.5 pg/ml);pORF5蛋白能促进THP-1细胞中NALP3炎性体mRNA的表达;NALP3-siRNA、ASC-siRNA及Caspase-1抑制剂预处理THP-1细胞后,IL-1β分泌量分别降低37.7％、71.3％和40.1％;p38抑制剂能降低NALP3炎性体mRNA及IL-1β分泌量(P＜0.01),但抑制NALP3炎性体后p38磷酸化水平未受影响(P＞0.05). 结论 pORF5质粒蛋白通过激活p38MAPK和NALP3信号通路共同调控IL-1β的产生和分泌.
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沙眼衣原体pORF5质粒蛋白诱发小鼠生殖道免疫损伤初步研究
目的 研究沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)pORF5质粒蛋白对小鼠生殖道组织的免疫损伤作用,并初步探讨其损伤机制.方法 表达纯化GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白经PreScission Protease酶切和去内毒素处理后分别在第1、3、6天接种于BALB/c小鼠阴道后穹窿,第7天处死小鼠,分离小鼠生殖道组织,肉眼大体观察并进行炎症病理评分；ELISA方法检测血清、阴道灌洗液和小鼠脾细胞培养上清中的TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子水平.结果 pORF5蛋白接种组小鼠输卵管壶腹部与峡部出现不同程度的肿胀,周围结缔组织发生黏连,并出现了不同程度的扭曲与积水,而PBS和GST(谷胱甘肽S-转移酶)蛋白对照组输卵管组织未出现明显改变；同时生殖道组织炎症病理积分明显高于PBS对照组(P＜0.01)和GST对照组(P＜0.01)；pORF5蛋白接种组小鼠脾细胞培养上清、阴道分泌物中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著高于PBS和GST蛋白对照组(P＜0.05)；血清中TNF-α、IL-1β水平显著高于PBS和GST蛋白对照组(P＜0.01).结论 pORF5蛋白能引起BALB/c小鼠生殖道组织免疫损伤,该损伤机制可能与TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子水平升高有关.
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沙眼衣原体pORF5质粒蛋白单克隆抗体2H4的纯化及其免疫学特性研究
目的 纯化抗沙眼衣原体pORF5单克隆抗体2H4并鉴定其免疫学特性.方法 大量培养pORF5单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株并收集培养上清,采用G蛋白免疫亲和层析法纯化2H4单克隆抗体；酶联免疫吸附试验(ELISA)测定2H4效价及抗体亚类；Western blot鉴定其特异性；免疫荧光试验(IFA)检测2H4单克隆抗体的衣原体种属特异性.结果 纯化后2H4抗体的纯度高达93％；效价为1:1024,免疫球蛋白类型为IgG2a;2H4抗体不仅能特异性识别pORF5融合蛋白,而且能特异性识别Ct血清型A、D、L2、鼠农原体(MoPn)、鹦鹉热嗜农原体(6BC)质粒所编码的内源性pORF5蛋白,但不识别衣原体其他质粒蛋白和肺炎嗜衣原体(Cpn).结论 获得了高纯度的能特异识别pORF5质粒蛋白的单克隆抗体,为进一步研究pORF5蛋白结构和功能以及沙眼衣原体诊断试剂盒的研制奠定了良好的基础.
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沙眼衣原体pORF5质粒蛋白免疫优势片段的筛选与鉴定
目的：鉴定沙眼衣原体pORF5质粒蛋白的免疫原性，并进一步筛选和确定pORF5质粒蛋白免疫优势片段。方法：以沙眼衣原体D血清型DNA为模板，设计pORF5基因全长和9个不同片段特异引物进行PCR扩增，PCR产物经BamHⅠ、NotⅠ双酶切后插入经同样双酶切的原核表达载体pGEX－6p中，构建pORF5质粒蛋白不同长度片段的原核表达重组体，重组体经PCR和测序鉴定后，转化XL1 Blue大肠杆菌表达10种不同长度的GST融合蛋白；ELISA方法检测pORF5质粒蛋白的免疫原性，Western blot鉴定pORF5质粒蛋白的免疫反应性；ELISA测定10个不同片段与沙眼衣原体生殖道感染患者血清、鼠免疫血清以及抗pORF5单克隆抗体的免疫反应性，鉴定pORF5质粒蛋白免疫优势片段。结果：pORF5质粒蛋白免疫原性强，能刺激机体产生高效价抗体；破坏pORF5质粒蛋白天然空间结构，其免疫反应性基本消失；在ELISA反应中，N端缺失66氨基酸的F6片段的免疫反应强度与pORF5全长基本相似， F2与F3出现较弱的免疫反应，其余片段免疫反应消失。结论：pORF5质粒蛋白为构象依赖性免疫优势抗原，其免疫优势表位和构象表位位于C端，本研究为进一步探讨pORF5质粒蛋白的生物学功能和疫苗的研制提供实验依据。
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沙眼衣原体pORF5质粒蛋白激活NALP3炎性复合体诱导THP-1细胞产生IL-1β和IL-18
目的：探讨沙眼衣原体（ Chlamydia trachomatis，Ct） pORF5质粒蛋白对IL-1β和IL-18等促炎性细胞因子的诱生作用，并初步分析其分子机制。方法：用0、3、6、12、24、36μg／ml不同浓度的pORF5蛋白刺激THP-1细胞，并于0、8、16、24、36 h收集上清及细胞，ELISA检测IL-1β和IL-18的含量；Realtime-PCR检测NALP3炎性复合体mRNA表达水平，Western blot鉴定Caspase-1活化状态；分别用NALP3 siRNA、ASC siRNA 转染THP-1细胞24 h或用Caspase-1特异性抑制剂（ Z-YVAD-FMK）预处理THP-1细胞30 min后，再用24μg／ml的pORF5质粒蛋白刺激THP-1细胞24 h，ELISA分析各处理因素对IL-1β和IL-18产生的影响。结果：pORF5质粒蛋白以浓度依赖的方式刺激THP-1细胞产生IL-1β和IL-18。当pORF5质粒蛋白浓度为24μg／ml时，IL-1β和IL-18的表达水平高，分别为491 pg／ml、186 pg／ml；同时pORF5质粒蛋白以时间依赖的方式刺激THP-1细胞产生IL-1β和IL-18，两者分别在24 h和16 h达到峰值。 pORF5质粒蛋白可增强THP-1细胞NALP3、ASC 和Caspase-1 mRNA的表达，促进Caspase-1的活化；NALP3-siRNA、ASC-siRNA及Caspase-1抑制剂处理组IL-1β和IL-18的产生水平均显著低于对照组（ P＜0.05）。结论：pORF5质粒蛋白通过激活NALP3炎性复合体诱导THP-1细胞分泌IL-1β和IL-18。
关键词： 沙眼衣原体 pORF5质粒蛋白 NALP3炎性复合体 IL-1β IL-18 -
沙眼衣原体pORF5质粒蛋白抑制肿瘤坏死因子α诱导HeLa细胞凋亡
目的 探讨沙眼衣原体质粒蛋白pORF5对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导HeLa细胞凋亡的影响.方法 将含pORF5基因的慢病毒重组表达载体与辅助质粒共转染293T细胞制备慢病毒,慢病毒收集浓缩后再感染HeLa细胞,流式细胞仪分选获得pORF5基因稳定转染细胞株(pORF5-HeLa),同时建立空载体转染对照细胞株(对照HeLa).将两种细胞株分别分为两组,一组用20μg/L TNF-α处理(处理组),一组仅用新鲜培养基培养(未处理组),作用6 h,Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态,流式细胞仪检测细胞凋亡率,实时PCR检测凋亡相关蛋白Caspase3、Bcl-2和Bax mRNA表达水平,Western印迹检测Bax、Bcl-2蛋白表达水平.结果 TNF-α处理细胞6 h后,Hoechst33258染色发现pORF5-HeLa和对照HeLa细胞中均可见不同程度的核固缩、碎裂,高亮蓝色凋亡小体;pORF5-HeLa细胞的凋亡率为(35.5±4.5)%,对照HeLa细胞凋亡率为(63.6±5.8)%,均显著高于相应未处理组[(9.5±1.5)%和(7.9±0.9)%,t值分别为13.53、32.36,均P<0.01].处理组pORF5-HeLa细胞中Bax和Caspase3 mRNA表达水平较处理组对照HeLa细胞分别降低72.8%和84.5%(t值分别为35.29,42.25,均P<0.01),但Bcl-2 mRNA的表达水平显著高于处理组对照HeLa细胞(t=87.12,P<0.01).处理组pORF5-HeLa细胞中Bax蛋白表达水平亦显著低于处理组对照HeLa细胞(t=17.58,P<0.01),而Bcl-2蛋白表达水平较对照HeLa细胞增加6.8倍,差异有统计学意义(t=18.93,P<0.01).结论 pORF5可能通过增强抗凋亡蛋白Bcl-2降低促凋亡蛋白Caspase3和Bax的表达,抑制TNF-α诱导的HeLa细胞凋亡.
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pORF5质粒蛋白拮抗LL37抗菌肽增强沙眼衣原体感染的初步研究
目的 探讨pORF5质粒蛋白能否通过抑制LL37抗菌肽增强沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)感染,并初步探讨其分子机制.方法 表达并纯化GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白经蛋白酶酶切制备不含GST标签的pORF5蛋白;pORF5蛋白和LL37单独或共孵育衣原体后再感染HeLa细胞,间接免疫荧光技术计数衣原体包涵体形成数量;荧光定量PCR检测TNF-α、LL37基因表达水平.结果 单独Ct感染组衣原体包涵体形成单位(IFU)为3.8×105/ml,LL37处理组IFU为2.0 × 105/ml,pORF5蛋白处理组IFU为3.0×105/ml,pORF5蛋白和LL37共处理组IFU为3.1×10/ml.pORF5蛋白处理组、LL37与pORF5蛋白共处理组和单独Ct感染组之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05),但明显高于LL37单独处理组(P＜0.05).pORF5蛋白和LL37共同处理组TNF-α表达水平明显高于LL37单独处理组(P＜ 0.01);pORF5蛋白处理组较Ct处理组LL37基因转录水平下降了19％.结论 pORF5质粒蛋白能拮抗LL37抗菌肽增强Ct感染,其机制可能与上调肿瘤坏死因子α、下调LL37表达相关.
