杜氏利什曼原虫前鞭毛体的培养和染色方法的改进

诊断黑热病可靠的方法是检查病人体内有无病原体.但有时由于所得的材料含虫量较少,涂片检查往往为阴性,给诊断带来一定困难.为提高病原体检出率和诊断率,常采用体外培养法培养出前鞭毛体(promastigote)后再进行制片,染色.培养时一般多采用三N(Nory-MacNeal-Nicoll)培养基,但通过多年实践,我们发现三N培养基由于温度的作用和在试管内较长时间的液体浸泡,使培养基变得脆而软,制片时出现许多琼脂碎片;涂片前也因反复洗涤离心的作用均影响了制片效果.为提高黑热病诊断依据和制片的质量,我们经反复试验,对三N培养基和涂片染色法进行了某些改进,效果很好.现介绍如下.

利什曼原虫前鞭毛体体外生长动力学研究

目的 观察不同种株利什曼原虫前鞭毛体在体外培养条件下的生长增殖情况,确定其适体外培养条件. 方法 分别使用RPMI 1640 和M 199复合培养液,观察温度、pH及新生小牛血清对硕大利什曼原虫、热带利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、墨西哥利什曼原虫、杜氏利什曼原虫前鞭毛体体外增殖速度与增殖周期的影响. 结果 当培养温度为26 ℃时,杜氏利什曼原虫前鞭毛体在含和不含新生小牛血清、pH中性、偏碱和偏酸的PMI 1640或M199复合培养基中,早期均能生长,且生长周期相对较长,其他种株利什曼原虫前鞭毛体在无血清或偏碱培养基中生长缓慢,增殖周期缩短;培养温度为37 ℃时,各种株利什曼原虫前鞭毛体均发生沉积,增殖停滞,不同程度地向无鞭毛体转化并发生死亡. 结论 使用复合培养液培养利什曼原虫前鞭毛体,温度、pH和新生小牛血清均可显著影响增殖速度和生长周期.各种株利什曼原虫前鞭毛体在相同培养条件下增殖速度和生长周期存在差异,可能与其遗传背景不同有关.

利什曼病疫苗研究进展

利什曼病是由利什曼原虫(Leishmania)所引起的一组疾病,不同虫种的感染导致完全不同的临床表现.内脏利什曼病是致死性疾病,皮肤及皮肤粘膜利什曼病则可能造成广泛而严重的皮肤损害甚至留下疤痕.虽然从古代开始人们就想获得有效的疫苗,但直至体外前鞭毛体的培养成功后才揭开了抗利什曼病疫苗研究的序幕,而绝大多数的科学试验是立足于抗皮肤利什曼病.

杜氏利什曼原虫前鞭毛体三种不同染色方法的比较

黑热病的主要诊断依据是检出患者体内存在无鞭毛体[1]，但有时由于所得的材料含虫量较少，骨髓等涂片检查往往为阴性，给诊断带来一定困难。为提高病原体检出率和诊断率，常采用体外培养法培养出前鞭毛体后再进行涂片，染色。所以杜氏利什曼原虫前鞭毛体标本是人体寄生虫学实验课程中必须观察的重点内容。杜氏利什曼原虫前鞭毛体标本通常用姬氏染色，鞭毛着色需要较长时间，课上操作费时。本文比较了3种不同的染色方法，其介绍如下。

利什曼原虫胞内寄生相关基因的研究

利什曼病是由利什曼原虫无鞭毛体寄生在包括人在内的哺乳动物巨噬细胞而引起的疾病,由杜氏利什曼原虫引起的内脏利什曼病若不治疗则会致命.研究者对寄生在白蛉属消化道内的前鞭毛体和寄生在巨噬细胞内的无鞭毛体胞内高表达基因或蛋白进行研究,筛选出一些特异基因,为利什曼原虫疫苗候选抗原的确定和靶作用药物的确定提供了科学依据.

核糖体小亚基RNA和细胞色素氧化酶亚单位Ⅱ基因在中国利什曼原虫系统发育学分析中应用的比较

目的 比较核糖体小亚基RNA(small subunit ribosomal RNA,SSUrRNA)和细胞色素氧化酶亚单位Ⅱ(cytochrome oxidaseⅡ,COXⅡ)这2种分子标志在中国利什曼原虫系统发育学分析中的不同. 方法 提取利什曼原虫各虫株核基因组和线粒体基因组,PCR方法扩增中国不同地区利什曼原虫SSUrRNA和COXⅡ基因,扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,序列碱基通过Clustal X软件比对,用DAMBE软件进行单倍型分析、Mega4软件计算遗传距离,Mrbayes3.1.2软件构建贝叶斯进化树. 结果 COXⅡ分析结果表明,流行于中国的利什曼原虫虫株未形成一个单系群;GS7和XJ771属于杜氏利什曼原虫复合体;10株利什曼原虫形成的6个单倍型(MHOM/CN/93/GS7,IPHUCN/77/XJ771,MHOM/CN/84/JS1和MGER/CN/60/GS-GER20除外)形成1个单系群;而SSUrRNA分析结果表明:11株利什曼原虫(IPHL/CN/77/XJ771,MH OM/CN/93/GS7,MRHO/CN/88/KXG-2,MHOM/CN/84/JS1,MGER/CN/60/GS-GER20除外)形成一个独立枝;江苏株JS1和热带利什曼原虫聚在一起,不与杜氏利什曼原虫聚在一起. 结论 SSUrRNA和COXⅡ得出的结果较一致,但COXⅡ基因在分析利仟曼原虫的系统发育关系时,可能是一个更可靠的遗传标志.

恰氏利什曼原虫毒性株及减毒株前鞭毛体GP63 mRNA稳定性的调控

杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的比较蛋白质组学分析

目的 应用蛋白质组学技术分析杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体蛋白质表达状况.方法 分别提取和纯化杜氏利什曼原虫四川 SC6株前鞭毛体与纯培养无鞭毛体的总蛋白,分别经pH3～10的预制胶条进行双向电泳分离,凝胶用考马斯亮蓝染色,凝胶网像以PDQuest 1.0软件分析,并对主要差异表达蛋白点用电喷雾质谱法进行鉴定.结果 等量的前鞭毛体与纯培养的无鞭毛体总蛋白经双向电泳分离后均可获近700个蛋白点,其中超过90%的蛋白点的分布和相对强度基本一致.与前鞭毛体比较,6个蛋白点在无鞭毛体蛋白中明显高表达.3个蛋白点低表达.6个明显高表达的蛋白点中有5个为已知功能蛋白,分别为Reiske铁硫蛋白前体、α微管蛋白、过氧化物酶1、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶前体和甘露糖-1-磷酸瓜氨酸转移酶;3个低表达的蛋白点中有2个为已知功能蛋白,分别为热休克蛋白70和B微管蛋白.这些差异调节表达蛋白与碳水化合物/能量代谢,应激反应,细胞膜和细胞骨架形成相关.结论 前鞭毛体与无鞭毛体蛋白质的表达存在差异.

RT-PCR检测亚马孙利什曼原虫P-4和GP-46基因表达

目的 证明亚马孙利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的基因表达水平.方法 用RNA分离试剂盒,分别提取3种不同来源的无鞭毛体(由小鼠模型皮损组织获得的无鞭毛体、由前鞭毛体培养转化而来的无鞭毛体,以及来自J774.G8巨噬细胞株的无鞭毛体)的总RNA,以及前鞭毛体总RNA,然后用SuperSc血Ⅱ逆转录聚合酶将其逆转录为cD-NA,再经PCR扩增无鞭毛体特异核酸酶(P-4)和前鞭毛体特异膜糖蛋白(GP-46)的特异片段,经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析.结果 3种不同来源的无鞭毛体均观察到P-4特异性条带(273 bp),且密度相似,但在前鞭毛体中未观察到;在前鞭毛体中观察到高表达的GP-46特异性条带(325 bp),但在3种无鞭毛体中弱表达.结论 由前鞭毛体转化的无鞭毛体能高水平表达亚马孙利什曼原虫无鞭毛体P-4特异基因,可为其生物化学及免疫学研究提供无鞭毛体来源.

河南省1例输入性皮肤利什曼病的诊断与分析

患者,男,2017年6月到乌兹别克斯坦务工,7月2日发现左胸臂部有2个小红疹,回国后于10月15日前后发现红疹变大,有少量脓液.用利什曼病快速检测试纸条检测患者血清利什曼原虫抗体结果为阴性.取皮损处组织镜检未查见利什曼原虫无鞭毛体.取皮损处组织置NNN培养基培养,培养至第8天镜检查见大量前鞭毛体.提取前鞭毛体DNA,用利什曼原虫属特异性引物K13A/K13B和L5.8S/LITSR分别扩增出120和350 bp的片段,片段序列与硕大利什曼原虫相应序列(GenBank登录号:EU370906.1和FN677342.1)的同源性分别为90％和98％.确诊患者为输入性皮肤利什曼病,病原体为硕大利什曼原虫. 患者经过葡萄糖酸锑钠注射液治疗2个疗程(总剂量7.2 g,每个疗程6d,两个疗程间隔1周),病情得到控制,现已康复.

河南省1例输入性皮肤利什曼病的诊断与分析

患者,男,2017年6月到乌兹别克斯坦务工,7月2日发现左胸臂部有2个小红疹,回国后于10月15日前后发现红疹变大,有少量脓液.用利什曼病快速检测试纸条检测患者血清利什曼原虫抗体结果为阴性.取皮损处组织镜检未查见利什曼原虫无鞭毛体.取皮损处组织置NNN培养基培养,培养至第8天镜检查见大量前鞭毛体.提取前鞭毛体DNA,用利什曼原虫属特异性引物K13A/K13B和L5.8S/LITSR分别扩增出120和350 bp的片段,片段序列与硕大利什曼原虫相应序列(GenBank登录号:EU370906.1和FN677342.1)的同源性分别为90％和98％.确诊患者为输入性皮肤利什曼病,病原体为硕大利什曼原虫.患者经过葡萄糖酸锑钠注射液治疗2个疗程(总剂量7.2g,每个疗程6d,两个疗程间隔1周),病情得到控制,现已康复.

婴儿利什曼原虫前鞭毛体细胞表面脂磷酸聚糖的提取及初步鉴定

本文主要介绍了两种不同来源脂磷酸聚糖(lipophosphoglycan,LPG)的提取方法,测定蛋白含量分别为50μg/mL和252μg/mL,并对其免疫源性及抗原性做了初步鉴定,ELISA法测出LPG可与抗-LPG免疫兔血清Ig和前鞭毛体免疫兔血清及黑热病病人血清反应,终点滴度有差别.