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弓形虫排泄-分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导体液免疫应答的动态观察
观察从Vero细胞与弓形虫速殖子共培养液分离的排泄-分泌抗原(Excreted-secreted antigens,ESA)鼻内免疫小鼠诱导的体液免疫应答及动态变化,为弓形虫复合黏膜疫苗候选抗原提供实验依据.BALB/c小鼠84只随机分为实验组和对照组,实验组以ESA为抗原(20μg/只),对照组用未接种弓形虫的细胞培养上清液20μL(μg/只),滴鼻免疫2次(间隔2周).分别于2次免疫后第1、2、3、4、5、6、7周颈椎脱位处死小鼠.EuSA法测定血清IgG、IgA,粪便sIgA及肠液sIgA.结果表明,免疫组小鼠血清IgG、IgA和粪便sIgA及肠液sIgA均增高.血清IgG、IgA水平分别第5周、第4周达高峰,免疫后第1～7周(P＜0.05)显著高于对照组.粪便sIgA第4周即达高峰,之后逐渐降低,至第7周仍(P＜0.05)显著高于对照组.肠液sIgA第4周达高峰,第2、3、4周(P＜0.05)高于对照组.可见,弓形虫ESA鼻内免疫BALB/c小鼠可有效诱导体液免疫应答,特异性抗体生成明显且可持续较长时间.
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霍乱毒素联合弓形虫排泄-分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导的GALT和NALT黏膜免疫应答
目的 观察霍乱毒素(CT)联合弓形虫排泄-分泌抗原(ESA)鼻内免疫小鼠诱导的肠相关淋巴组织(GALT)和鼻相关淋巴组织(NALT)黏膜部位的免疫应答.方法 将48只5～6周龄BABL/c小鼠随机均分为3组,分别用PBS、ESA和CT+ESA滴鼻免疫小鼠2次,间隔2周.末次免疫后14 d,处死小鼠,ELISA测定小鼠粪便和鼻咽冲洗液sIgA抗体水平;计数派伊尔淋巴集结(PP)、肠上皮淋巴细胞(IEL)、NALT和鼻通道(NC)淋巴细胞数,免疫细胞化学法检测CD4+、CD8+T细胞亚群水平.结果 免疫后14 d,CT+ESA组小鼠鼻咽冲洗液和粪便sIgA水平显著高于ESA组和PBS组(P＜0.01);CT+ESA和ESA组小鼠GALT部位的PP淋巴细胞显著增生,主要以CD4+T细胞为主;而IEL以CD8+T细胞增生为主,CD4+/CD8+比值降低(P＜0.05).CT+ESA NALT内淋巴细胞明显增生.CT+ESA组NC淋巴细胞显著升高(P＜0.01),以CD4+T细胞增生为主.结论 CT佐剂联合ESA滴鼻免疫BALB/c小鼠可诱导GALT和NALT黏膜部位免疫应答.
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弓形虫排泄-分泌抗原和可溶性速殖子抗原免疫原性的观察
目的 观察弓形虫速殖子排泄-分泌抗原(excreted/secreted antigen, ESA)和可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen, STAg)鼻内免疫小鼠的免疫原性. 方法 BALB/c小鼠随机分为4组,分别用PBS 20 μl/只、体外排泄-分泌抗原(excreted/secreted antigen in vitro, ESAv)、腹腔排泄-分泌抗原(excreted/secreted antigen in mice, ESAm)和STAg各20 μg/只鼻内免疫2次,间隔14 d.分别于末次免疫后14 d和44 d每组处死8只小鼠,计数肠上皮内淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocytes,iIEL)和脾淋巴细胞,ELISA法检测血清IgG和小肠冲洗液sIgA抗体水平. 结果 实验期间,ESAm组小鼠于二次免疫后状态欠佳,其他各组小鼠健康状况良好.末次免疫后14 d,各抗原组脾淋巴细胞及iIEL均增殖活跃,细胞数与PBS组比较,差异具统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);至免疫后44 d,两种ESA组脾淋巴细胞及iIEL数与PBS组比较差异具统计学意义(P＜0.05).各抗原组血清IgG水平在免疫后14 d和44 d均明显增高,与PBS组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).免疫后14 d肠液sIgA水平ESAv、ESAm和STAg组与PBS组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01),ESAm和STAg组与ESAv组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01),两种ESA组在免疫后44 d与PBS组比较差异仍具统计学意义(P<0.05). 结论 ESAv、ESAm和STAg鼻内免疫均可诱导粘膜及系统的细胞和体液免疫应答,有较强的免疫原性.但ESAm可能对机体有毒副作用,不适宜直接鼻内免疫.
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利用弓形虫病人血清筛选弓形虫速殖子特异性抗原
目的 筛选能引起人体免疫反应的弓形虫抗原标记.方法 利用实验室保存的9份弓形虫病人血清标准品、6份阴性血清标准品,以及2份弓形虫病人血清国际标准品作为一抗,分别与刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株的可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen,STAg)和排泄-分泌抗原(excreted/secreted antigens,ESA)进行免疫印迹反应.结果 发现STAg中有10条蛋白带与所用阳性血清均发生免疫反应;ESA中有4条蛋白带能与所有阳性血清发生免疫反应,这些蛋白与阴性血清均不发生免疫反应.其中分子量为30、35、49、50、54kDa的STAg抗原以及分子量为23、24、28kDa的ESA抗原能与所用阳性血清发生较强免疫反应.结论 本实验结果将有助于寻找在弓形虫病人体内能够引起免疫反应的弓形虫诊断抗原和免疫保护性抗原,为弓形虫诊断试剂以及疫苗开发奠定初步基础.
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弓形虫ESA鼻内免疫小鼠诱导的黏膜及系统免疫应答
目的 观察弓形虫排泄-分泌抗原(excreted-secreted antigen,ESA)鼻内免疫小鼠诱导黏膜和系统免疫应答的效果.方法 将64只BALB/c小鼠随机分为8个组,每组8只.实验组小鼠分别用腹腔感染弓形虫小鼠第0,6,12,24,36,48和60小时无菌收集的腹腔液中获取的ESA 20 μg/只滴鼻免疫小鼠2次,间隔14 d,以PBS20 μl/只滴鼻为对照.逐日观察小鼠状况,于末次免疫后第14天颈椎脱位处死小鼠,检测血清特异性IgG、小肠冲洗液sIgA水平,分离肠上皮内淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocytes,iIEL)及肠系膜淋巴结淋巴细胞(mesenteric lymph node lymphocytes,MLNL)并计数.结果 60 h组小鼠初次免疫后第8-11天,有倦怠、饮水及采食量减少等表现,体重增长较其他组缓慢(P＜0.05),其他组小鼠健康状况良好.不同时相ESA鼻内免疫小鼠后特异性抗体水平升高,MLNL、iIEL发生增殖性应答.48 h组和60 h组各项指标均明显高于0 h组(P＜0.01)及PBS组(P＜0.05).结论 48 h和60 h弓形虫ESA均能诱导黏膜及系统免疫应答,但60h ESA可能对机体有毒副作用,不适宜直接滴鼻免疫,48 h ESA可作为弓形虫黏膜疫苗的候选抗原.
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ESA和STAg鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染作用
目的 观察弓形虫速殖子排泄一分泌抗原(excreted/secreted antigen,ESA)和可溶性速殖子抗原(solubletachyzoite antigen,STAg)鼻内免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染作用.方法 BALB/c小鼠64只随机分为4组,每组16只,分别用磷酸盐缓冲液(PBS)(对照组)20μl/只、体外排泄-分泌抗原(excreted/secreted antigen in vitro,ESAv)20μg/只、腹腔排泄-分泌抗原(excreted/secreted antigen in mice,ESAm)20μg/只和STAg20μg/只滴鼻免疫小鼠2次,间隔14 d.末次免疫后14 d每组处死8只小鼠,ELISA法检测血清IgG和小肠冲洗液sIgA.每组剩余8只小鼠用RH株弓形虫速殖子1×106个/只灌胃攻击,记录小鼠健康情况.攻击后30 d处死小鼠,计数脾、脑组织内弓形虫虫荷(速殖子数).结果 ESAm组小鼠于2次免疫后出现轻微竖毛、倦怠等症状,其他各组小鼠健康状况良好.免疫后14 d,各抗原组血清lgG水平均明显高于对照组(P<0.001);ESAv(P<0.05)、ESAm(P<0.001)和STAg(P<0.001)组肠液sIgA水平明显高于对照组,EsAm(P<0.001)和sTAg(P<0.05)组高于EsAv组.弓形虫攻虫后:30 d,各抗原组小鼠脾、脑组织内虫荷显著低于对照组(P<0.01),EsAv、ESAm和sTAg组脾内速殖子减虫率分别为49.2%,49.52%和51.94%,脑内减虫率分别为46.83%,50.81%和51.18%.结论 ESAv、ESAm和STAg鼻内免疫均能产生抗弓形虫感染的部分保护,但ESAm可能对机体有毒副作用,不适宜直接鼻内免疫.
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弓形虫排泄-分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导的脾与肠相关淋巴组织细胞免疫效应及动态变化
目的 观察弓形虫与Vero细胞共培养提取的排泄-分泌抗原(ESA)鼻内免疫BALB/c小鼠诱导的脾及肠相关淋巴组织(GALT)细胞免疫效应及动态变化.方法 84只BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,实验组以ESA(20 μg/只)为抗原,对照组用未接种弓形虫的细胞培养上清液(20 μl/只),鼻内免疫2次,间隔2周.末次滴鼻后第1、2、3、4、5、6、7周处死小鼠,分离脾、派伊尔结(PP)及小肠上皮内淋巴细胞(IEL)并计数.结果 实验组小鼠脾淋巴细胞第3周达高峰,第1、2、3周明显高于对照组;PP淋巴细胞明显增生,第3周达高峰,第1、2、3、4、5周显著高于对照组;IEL第2周增生达高峰,第1～3周显著高于对照组.结论 弓形虫ESA鼻内免疫BALB/c小鼠可有效诱导不同黏膜部位及系统特异性的细胞免疫应答,且可持续较长时间.
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猪旋毛虫病胶体金检测试纸条的制备
目的 制备猪旋毛虫病胶体金检测试纸条,并进行验证.方法 采用免疫胶体金技术标记猪旋毛虫排泄-分泌(Excretory-secretory,ES)抗原,在AE98NC膜上点上兔抗猪IgG作为检测带,抗ES抗原抗体作为对照带,将NC印膜、胶体金抗原玻璃棉、吸水纸和支持板用胶膜组成试纸条,进行敏感性、特异性和重复性验证,并与ELISA检测方法进行对比.结果 试纸条检测38头份猪旋毛虫阳性血清的敏感性为97.37%;检测33头份猪蛔虫阳性血清、26头份猪囊虫阳性血清、21头份猪细颈囊尾蚴阳性血清和98头份猪旋毛虫阴性血清的特异性为98.88%;重复性好;与EIASA检测方法的敏感性和特异性差异无统计学意义(P>0.05).结论 已制备猪旋毛虫病胶体金检测试纸条,该试纸条敏感、特异、简便、快速,可用于猪旋毛虫病的检疫及流行病学调查.
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刚地弓形虫排泄-分泌抗原体外诱导的IFN-γ促CD4+CD25+调节性T细胞凋亡作用
目的 研究刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株和TgCtwh3株排泄-分泌抗原(ESA)体外诱导小鼠CD4+CD25+调节性T细胞凋亡和IFN-γ分泌方面的差异. 方法 分别制备刚地弓形虫RH株和TgCtwh3株的ESA.将分离的野生型C57BL/6小鼠脾单个核细胞随机分为3组(每孔2×106细胞),分别加入RH株ESA、TgCtwh3株ESA(均为10 μg/ml)和鸡卵清蛋白(OVA)进行诱导刺激,流式细胞术检测各组诱导刺激48 h和72 h的CD4 +CD25+调节性T细胞的早期凋亡情况,ELISA检测各组诱导刺激72 h细胞培养上清中的γ干扰素(IFN-γ)分泌水平.另外,将分离的野生型C57BL/6小鼠脾单个核细胞随机分为2大组(每孔 2×106细胞),其中—大组在分别加入两株ESA(10μg/ml)和OVA的同时加入抗IFN-γ中和抗体(10 μg/ml)进行诱导刺激72 h,流式细胞术检测各组CD4+CD25+调节性T细胞早期凋亡情况.用两虫株ESA (10μg/ml)及OVA分别诱导刺激IFN-γ基因敲除型和野生型C57BL/6小鼠的脾单个核细胞(每孔2×106细胞)72 h后,流式细胞术检测各组CD4+CD25+调节性T细胞早期凋亡情况. 结果 制备的刚地弓形虫RH株和TgCtwh3株ESA抗原蛋白浓度分别为0.54 mg/ml和2.14 mg/ml.流式细胞术检测结果显示,RH株和TgCtwh3株ESA组诱导刺激48 h后,CD4+CD25+调节性T细胞的早期凋亡率分别为(12.90±1.26)％和(9.71±1.04)％,均显著高于OVA对照组(4.48±0.48)％(P＜0.01);诱导刺激72 h后,RH株ESA组诱导CD4+CD25+调节性T细胞的凋亡率为(15.21±1.11)％,仍明显高于TgCtwh3株ESA组(11.02±0.92)％(P＜0.05)和OVA对照组(10.10±1.49)％(P＜0.01).ELISA检测结果显示,RH株和TgCtwh3株ESA组诱导刺激脾单个核细胞72 h的培养上清中分泌的IFN-γ水平分别为(4 764.0±118.7) pg/ml和(3 629.0±33.6) pg/ml(P＜0.01),均显著高于OVA对照组的(679.4±30.6) pg/ml (P＜0.01).流式细胞术检测结果显示,RH株ESA加抗IFN-γ中和抗体组诱导CD4+CD25+调节性T细胞的早期凋亡率为(10.44±1.44)％,明显低于未加抗IFN-γ中和抗体组(14.96±0.83)％(P＜0.05);但TgCtwh3株ESA加抗IFN-γ中和抗体与否诱导CD4+CD25+调节性T细胞的早期凋亡率变化不大(P＞0.05).RH株ESA诱导IFN-γ基因敲除小鼠的CD4+CD25+调节性T细胞凋亡率为(10.64±0.55)％,明显低于野生型小鼠的(15.21±1.11)％(P＜0.01);TgCtwh3株ESA诱导两组小鼠的CD4+CD25+调节性T细胞凋亡率的差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 刚地弓形虫RH株ESA在体外诱导CD4+CD25+调节性T细胞凋亡及促IFN-γ分泌强于TgCtwh3株ESA.弓形虫ESA诱导机体产生IFN-γ可通过介导调节性T细胞凋亡来促进弓形虫感染早期抗感染免疫力的形成.
关键词： 刚地弓形虫 排泄-分泌抗原 CD4+CD25+调节性T细胞 细胞凋亡 γ-干扰素 -
刚地弓形虫蛋白质组学研究进展
近10年,蛋白质组学技术广泛应用于刚地弓形虫研究中,研究结果为全面深入揭示该虫体的生命活动本质奠定了基础.目前,关于刚地弓形虫的整体蛋白质组学研究仅限于速殖子和卵囊阶段的蛋白质组学;亚蛋白质组学研究包括一些重要抗原,如可溶性速殖子抗原、糖蛋白和免疫蛋白质组学研究等;差异蛋白质组学研究着眼于阐明不同虫株或不同虫种的差异蛋白.本文综述了弓形虫蛋白质组学的研究现状,详细阐述了弓形虫整体蛋白质组学、亚蛋白质组学和差异蛋白质组学的主要研究进展.此外,本文还概述了弓形虫蛋白质组学的生物信息学平台,并对弓形虫蛋白质组学的应用前景进行了展望.
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旋毛虫相对分子质量53 000抗原蛋白基因克隆载体的构建
目的:构建编码旋毛虫相对分子质量53 000 抗原蛋白基因(Ts53)的克隆载体并进行序列分析.方法:应用RT-PCR方法从河南省猪源旋毛虫肌幼虫总RNA中扩增目的基因Ts53,将PCR产物克隆入pUC18载体中构建重组质粒pUC18-Ts53,进行测序及同源性分析.结果:克隆了旋毛虫肌幼虫的Ts53基因,所获基因的核苷酸序列与GenBank所登录的旋毛虫Ts53蛋白基因序列的同源性为99.06%.应用Kyte-Doolittle方法进行氨基酸的亲水性分析表明,53 000蛋白抗原性强的部位可能位于220～230氨基酸残基处.结论:成功构建了旋毛虫相对分子质量53 000蛋白抗原基因的克隆载体pUC18-Ts53,为Ts53基因的表达奠定了基础.
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小鼠感染旋毛虫后血清抗体水平的变化
目的 观察小鼠感染旋毛虫后血清抗体水平的变化. 方法 12只昆明小鼠每只经口感染旋毛虫肌幼虫300条,感染后11-28d每天尾静脉采血,分离血清,应用旋毛虫肌幼虫ES抗原ELISA检测血清抗体水平.结果 小鼠感染旋毛虫后11d血清抗体阳性率为8.33%(1/12),感染后14d、20d的抗体阳性率分别升至16.67%(2/12)与58.33%(7/12),感染后24d抗体阳性率达100%(12/12)并持续至实验结束时的28d.小鼠感染旋毛虫后的血清抗体阳性率与感染后时间有显著的相关性(r=0.984,P<0.05);血清抗体水平随感染后时间的延长而升高(F=177.427,P<0.05).结论 小鼠感染旋毛虫后血清抗体水平随感染后时间的延长而升高,感染小鼠全部检出抗旋毛虫抗体的时间为感染后24d.
