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rAAV-hGDNF对谷氨酸钠诱导原代培养大鼠胚胎脊髓神经元损伤的保护作用
目的探讨rAAV-hGDNF对谷氨酸钠诱导的大鼠脊髓神经元死亡的保护作用. 方法建立谷氨酸钠诱导体外培养大鼠脊髓神经元损伤模型,用自行包装的rAAV-hGDNF病毒感染原代培养大鼠脊髓神经元,经双醋酸荧光素和碘化丙啶法辨认存活细胞和死亡细胞,观察rAAV-hGDNF抑制兴奋性氨基酸对脊髓神经元的毒性作用;同时运用半定量RT-PCR法,以β-actin为内对照,检测脊髓神经元内NOS mRNA的表达. 结果 rAAV-hGDNF感染组的细胞死亡率为50%±0.02,对照组为59.25 %±0.023,统计分析两组有显著性差异(P<0.05).rAAV-hGDNF感染后的脊髓神经元N OS mRNA表达为0.97±0.05,未感染rAAV-hGDNF的对照组NOS mRNA表达为1.23±0.10 ,统计分析两组有显著性差异(P<0.01). 结论 rAAV-hGDNF能抑制兴奋性氨基酸诱导的神经元NOS的表达,增加体外培养的神经元对兴奋性氨基酸神经毒性的抵抗能力.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 腺病毒相关病毒 脊髓神经元 一氧化氮合酶 -
腺病毒相关病毒增强型mIL-10质粒的构建及表达
构建腺病毒相关病毒增强型mIL-10质粒,并在心肌细胞内进行表达.利用分子克隆技术,将腺病毒相关病毒(AAV)中的末端重复序列(ITR)插在pORF5-mIL-10质粒启动子的上游,构建pORF-AAV-mIL-10质粒.在阳离子脂质体Lipofectin介导下,pORF5-mIL-10和pORF-AAV-mIL-10分别转染次代培养心肌细胞,TRIzol一步法提取总RNA,RT-PCR检测mIL-10的mRNA;ELISA检测培养细胞上清中mIL-10的表达.结果是用双酶切证实成功构建质粒,分别在转染24 h、48 h、72 h、96h、120 h后,用RT-PCR在心肌细胞中检测到相应的目的条带,ELISA检测各组mIL-10的表达量.证实在阳离子脂质体Lipo-fectin介导下,pORF-AAV-mlL-10能在一定时间内稳定的增加mIL-10在心肌细胞内的表达.
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Nurrl基因在大鼠体外培养骨髓基质细胞的表达
目的:为获得高效表达孤儿核受体(orphan nuclear receptor,Nurrl)基因的骨髓基质细胞.方法:采用分子克隆技术,构建携带Nurrl基因的重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体;与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒phelper一起用磷酸钙法转染包装细胞HEK293制备具有感染活性的AAV-Nurrl病毒粒子;用病毒上清液感染原代培养的大鼠骨髓基质细胞(Marrow stromal cells,MSCs),并用免疫细胞化学方法检测阳性细胞.结果:经酶切鉴定和DNA测序,得到了序列正确的重组pAAV-Nurrl;感染HT1080细胞进行病毒滴度测定,每mL病毒贮存液可达1012个阳性细胞;获得了Nurrl阳性的骨髓基质细胞,阳性率在60%以上.结论:重组AAV携带的Nurrl基因能够在MSCs中表达,本文为进一步探讨将该细胞用于帕金森病基因治疗的可能性研究奠定了基础.
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腺病毒相关病毒载体的研究进展
实现基因治疗的关键在于目的基因的高效转移并适度表达,这将直接影响其治疗的效率和安全性.因此,探寻理想的基因转移载体显得尤为重要.腺病毒相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是一种缺陷型的单链DNA病毒,既可以转染分裂细胞又可以转染非分裂细胞.AAV在宿主体内以定向整合的方式存在.AAV重组体在细胞内能长期稳定地表达,且在体内不引起明显的病理变化,表明AAV作为基因治疗的载体是安全、有效和可行的.
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人肝癌特异性 HSV-TK/GCV重组腺病毒相关病毒质粒的构建与研究
目的构建肝癌特异性HSV-TK/GCV重组腺病毒相关病毒质粒并了解其在细胞内的表达.方法以腺病毒相关病毒的质粒WAV2作为载体,将TK基因插在甲胎蛋白(AFP)增强子/白蛋白启动子(AFP增强子/ALB启动子)的调控基因的下游,重组成pWAV2/AFP-ALB/HYTK质粒载体.同时构建质粒载体pEGFP-1/AFP-ALB.然后将上述两种不同载体分别转入AFP阳性表达的HepG2细胞株以及阴性表达的7721、SPC和7901细胞株.结果绿色荧光蛋白只在AFP阳性表达的HepG2细胞株表达,采用PCR技术,以HSV-TK的引物扩增所抽提的总DNA中,只有AFP阳性表达的HepG2细胞株扩增出了710 bp的DNA片段.结论pWAV2/AFP-ALB/HYTK质粒载体在体外实验中具有很好的靶向性.
