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阿托伐他汀下调大鼠心肌梗死后线粒体融合素2表达和细胞凋亡
目的 研究阿托伐他汀通过下调线粒体融合素2表达抑制大鼠心肌梗死后细胞凋亡.方法 雄性SD大鼠48只,随机分为假手术组(sham),心肌梗死组(MI),阿托伐他汀1组(statin 1)和2组(statin 2),每组12只.分别于术前7天开始每日灌胃,给予阿托伐他汀10和40 mg/kg,MI组以蒸馏水灌胃,随后结扎大鼠前降支建立心肌梗死模型.术后24 h用TUNEL法检测心肌细胞凋亡,免疫组化法检测线粒体融合素2表达,免疫印迹法检测磷酸化蛋白激酶B (p-Akt)表达.结果 与sham组相比,MI组心肌细胞凋亡显著增加,线粒体融合素2表达显著增加,p-Akt表达显著下降(P＜0.01);与MI组相比,statin 1和2组心肌细胞凋亡和线粒体融合素2表达均显著降低(P＜0.05),而p-Akt表达显著增高(P＜0.05),且statin 2组较1组变化更显著(P＜0.05).结论 阿托伐他汀可抑制大鼠心肌梗死后的细胞凋亡,其作用可能与下调线粒体融合素2表达有关.
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去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因与血管平滑肌细胞增殖
背景:线粒体融合素2基因作用于血管平滑肌细胞Ras蛋白,通过胞外信号调节蛋白激酶1/2通路抑制细胞增殖.线粒体融合素2基因氨基酸序列第442位丝氨酸为蛋白激酶A磷酸化位点,与其磷酸化状态密切相关,能参与其功能调控.目的:观察大鼠线粒体融合素2基因在去除蛋白激酶A磷酸化位点后对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其相关信号通路.方法:利用已构建的携带绿色荧光蛋白基因、线粒体融合素2基因和去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因的3种重组腺病毒,感染大鼠主动脉血管平滑肌细胞,将其传代培养3～10代后以抽签法随机分为4组:①不加干预的对照组.②感染携带绿色荧光蛋白的对照组(Adv-GFP组).⑨感染携带线粒体融合素2基因的实验组(Adv-Mfn2组).④感染携带去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因的实验组(Adv-Mfn2-PKA(△)组).激光共聚焦显微镜观察完整的和去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因在细胞中的定位.Westernblot检测p-ERK1/2表达水平及完整的和去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因在血管平滑肌细胞中的表达.MTT法绘制细胞生长曲线.结果与结论:完整的和去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因在血管平滑肌细胞中均表达蛋白特异性条带.两种基因表达产物都主要分布于线粒体外膜.与对照组和Adv-GFP组相比,Adv-Mfn2组吸光度值在第3,4,5,6天都显著降低(P＜0.01＝,Adv-Mfn2-PKA(△)组吸光度值无明显变化.与对照组和Adv-GFP组相比,Adv-Mfn2组p-ERK1/2表达水平显著降低(P＜0.01＝,Adv-Mfn2-PKA(△)组无明显变化.提示去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因定位于线粒体外膜,对血管平滑肌细胞的增殖无拮抗作用,对胞外信号调节蛋白激酶1/2通路无抑制作用.
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瑞舒伐他汀对大鼠心肌梗死后细胞凋亡及对线粒体融合素2表达的影响
目的：研究不同剂量瑞舒伐他汀对大鼠心肌梗死后细胞凋亡及线粒体融合素2蛋白表达的影响。方法选取雄性 SD大鼠48只，随机分为假手术组（Sham），心肌梗死组（MI），瑞舒伐他汀1组（Statin 1）和瑞舒伐他汀2组（Statin 2），每组12只。 Statin 1组术前7 d开始每日给予瑞舒伐他汀5 mg／kg灌胃，Statin 2组药物剂量为每日20 mg／kg，MI组以蒸馏水灌胃，随后制备心肌梗死模型。术后24 h采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（ TUNEL）检测细胞凋亡，免疫印迹法检测磷酸化蛋白激酶B（ p-Akt）的表达，免疫组化法检测线粒体融合素2的表达。结果与Sham组相比，MI组及Statin 1组、2组心肌细胞凋亡显著增加，p-Akt表达显著下降，线粒体融合素2表达显著增加（P＜0.01）；与 MI组相比，Statin 1组、2组心肌细胞凋亡和线粒体融合素2表达均显著降低（P＜0.05），而p-Akt表达显著增高（P＜0.05），且Statin 2组较1组变化更显著（P＜0.05）。结论瑞舒伐他汀可抑制大鼠心肌梗死后的细胞凋亡，其作用可能与抑制线粒体融合素2表达有关。
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RNAi介导线粒体融合素2基因沉默导致BALB/c小鼠葡萄糖代谢紊乱和胰岛素抵抗
目的 研究RNA干扰(RNAi)介导线粒体融合素2(mitofusin-2,Mfn2)基因沉默对BALB/c小鼠葡萄糖代谢和胰岛素敏感性的影响.方法 构建带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的Mfn2短发卡RNA质粒载体(Mfn2 shRNA)和阴性对照质粒载体(HK).44只BALB/c小鼠分为转染组(Mfn2)和阴性对照组.将含有75μg质粒溶液1.5 ml以流体力学法注入小鼠体内.质粒注射5 d后,采用腹腔葡萄糖耐量和胰岛素耐量试验观察Mfn2基因干扰对小鼠葡萄糖代谢和胰岛素敏感性的影响;采用氚标记葡萄糖(3-[~3H]-葡萄糖)通过尾静脉注射到小鼠体内,留取血标本,液体闪烁计数仪测定标本放射性浓度,计算小鼠肝脏葡萄糖生成率;Western印迹法检测肝脏组织中Mfn2蛋白表达.结果 与阴性对照组小鼠比较,Mfn2组小鼠肝脏组织Mfn2蛋白表达明显减少(8.05±0.15对8.56±0.01,P<0.05),空腹血糖升高[(6.95±0.83对4.68±0.29)mmol/L,P<0.05],胰岛素敏感性下降,肝脏葡萄糖生成增加[(49.43±16.31对24.91±4.07)μmol·kg~(-1)·min~(-1),P<0.05].结论 下调Mfn2基因表达使BALB/c小鼠葡萄糖代谢异常和胰岛素抵抗,Mfn2基因在维持体内葡萄糖代谢稳态中起重要作用.
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去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因对血管平滑肌细胞凋亡的影响
目的 研究大鼠线粒体融合素2基因在去除蛋白激酶A磷酸化位点后对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响及其相关的信号通路.方法 利用携带去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因重组腺病毒(AdvMfn2-PKA(△))和携带线粒体融合素2基因的重组腺病毒(Adv-Mfn2),感染培养的大鼠血管平滑肌细胞.免疫印迹分析相关蛋白的表达;激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位;细胞凋亡酶联免疫吸附法比较其对细胞凋亡的影响;免疫印迹法分析磷酸化蛋白激酶B蛋白表达变化.结果 外源基因转染后可表达特异性蛋白产物;激光共聚焦显微镜显示去除蛋白激酶A磷酸化位点后的线粒体融合素2基因表达产物主要分布于线粒体外膜;酶联免疫吸附法检测显示去除蛋白激酶A磷酸化位点后,线粒体融合素2基因诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡作用显著减弱(P＜0.01),与空白对照组差异无显著性;免疫印迹检测表明Mfn2-PKA(△)组磷酸化蛋白激酶B表达较Mfn2组显著升高(P＜0.01),与空白对照组差异无显著性.结论 去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因表达产物仍主要分布于线粒体外膜,但其诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用丧失,对蛋白激酶B信号通路也无抑制作用.这表明蛋白激酶A磷酸化位点是调控线粒体融合素2基因诱导血管平滑肌细胞凋亡的重要功能位点.
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线粒体融合素2基因突变体对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响
目的 研究大鼠线粒体融合素2基因的蛋白激酶A磷酸化位点两种突变体对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其相关的信号通路.方法 利用两种携带蛋白激酶A磷酸化位点突变的线粒体融合素2基因重组腺病毒(Adv-Mfn2-alaPKA和Adv-Mfn2-asnPKA)和携带线粒体融合素2基因的重组腺病毒(Adv-Mfn2),感染培养的大鼠血管平滑肌细胞.水溶性四甲基偶氮唑盐法比较各组细胞增殖的变化;流式细胞术比较各组细胞周期的变化;免疫印迹法比较各组线粒体融合素2基因和磷酸化细胞外调节激酶1/2蛋白表达变化.结果 感染重组腺病毒的三组细胞线粒体融合素2基因表达差异无显著性.与对照组相比,Adv-Mfn2-alaPKA和Adv-Mfn2组显著抑制细胞增殖(P<0.01),停滞于G_0/G_1期细胞比例显著增加(P<0.01),磷酸化细胞外调节激酶1/2蛋白表达水平显著降低(P<0.01),且Adv-Mfn2-slaPKA作用更明显(P<0.01),而Adv-Mfn2-asnPKA组较对照组差异无显著性.结论 Mfn2-alaPKA通过细胞外调节激酶1/2信号通路抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用较线粒体融合素2基因更明显;而Mfn2-asnPKA对血管平滑肌细胞无抑制增殖的作用,对细胞外调节激酶1/2信号通路也无作用.蛋白激酶A磷酸化位点是调控线粒体融合素2基因抗血管平滑肌细胞增殖的重要功能位点.
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瑞舒伐他汀对大鼠心肌缺血再灌注后细胞凋亡及线粒体融合素2表达的影响
目的：探讨瑞舒伐他汀对大鼠心肌缺血再灌注损伤后细胞凋亡及线粒体融合素2蛋白表达的影响。方法选取雄性SD大鼠32只，随机分为假手术（Sham）组、缺血再灌注（I/R）组、瑞舒伐他汀1（Statin 1）组和瑞舒伐他汀2（Statin 2）组，每组8只。 Statin 1组术前7天开始给予瑞舒伐他汀5 mg/（kg· d）灌胃，Statin 2组药物剂量为20 mg/（kg· d），I/R组以蒸馏水灌胃，随后制备心肌缺血再灌注损伤模型。各组于再灌注3 h后剪取心脏缺血再灌注损伤区域，脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测细胞凋亡，免疫印迹法检测磷酸化蛋白激酶B（ p-Akt）的表达，免疫组化法检测线粒体融合素2的表达。结果与Sham组相比，I/R组及Statin 1、2组心肌细胞凋亡显著增加，p-Akt表达显著下降，线粒体融合素2表达显著增加（ P＜0.01）；与I/R组相比，Statin 1、2组心肌细胞凋亡和线粒体融合素2表达均显著降低（P＜0.05），而p-Akt表达显著增高（P＜0.05），且Statin 2组较Statin 1组变化更显著（P＜0.05）。结论瑞舒伐他汀可抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤后的细胞凋亡，其作用可能与抑制线粒体融合素2表达有关。
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阿托伐他汀通过下调线粒体融合素2表达抑制大鼠心肌缺血再灌注后细胞凋亡
目的 研究阿托伐他汀对大鼠心肌缺血再灌注(I/R)损伤后细胞凋亡及线粒体融合素2表达的影响.方法 选取雄性SD大鼠32只,随机分为假手术组(sham),缺血再灌注组(L/R),阿托伐他汀1组(statin1)和阿托伐他汀2组(statin2),每组8只.Statin 1组术前7d开始每日给予阿托伐他汀10 mg/(kg·d)灌胃,statin 2组药物剂量为40 mg/(kg·d),I/R组以等体积蒸馏水灌胃,随后制备心肌I/R损伤模型.各组于再灌注3h后剪取心脏I/R损伤区域,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,免疫印迹法检测磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的表达,免疫组化法检测线粒体融合素2的表达.结果 与sham组相比,I/R组及statin 1组、statin 2组心肌细胞凋亡显著增加,p-Akt表达显著下降,线粒体融合素2表达显著增加(P＜0.01)；与I/R组相比,statin 1组、statin 2组心肌细胞凋亡和线粒体融合素2表达均显著降低(P＜0.05),而p-Akt表达显著增高(P＜0.05),且statin 2组较statin 1组变化更显著(P＜0.05).结论 阿托伐他汀可抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤后的细胞凋亡,其作用可能与抑制线粒体融合素2表达有关.
