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黄芪注射液对低氧低糖/复氧复糖大鼠海马神经元JNK3表达的影响
目的 观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元C-JUN氨基末端激酶(JNK3)表达的影响.方法 取原代培养8d大鼠海马神经元,随机分为正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组(模型组)、黄芪注射液组和溶媒对照组.模型组缺氧缺糖0.5h再复氧复糖,于复氧复糖后0、0.5、2、6、24、72和120h用免疫组化法和免疫印迹法检测海马神经元JNK3表达.结果除120 h之外,模型组JNK3阳性神经元数目和蛋白平均吸光度值在各个时间点均比对照组明显增多(29.3±1.3 vs 3.1±0.8,P＜0.05;0.765±0.06 vs 0.448±0.06,P＜0.05);黄芪注射液组JNK3阳性神经元数目和蛋白平均吸光度值均比模型组明显减少(18.2±1.5 vs 29.3±1.3,P＜0.05;0.658±0.04vs 0.765±0.06,P＜0.05).结论 黄芪注射液可抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元JNK3表达,并因此抑制神经元凋亡.
关键词： 缺氧缺糖/复氧复糖 黄芪注射液 c-Jun氨基末端激酶 海马神经元 -
缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞损伤的动态观察
目的 探讨缺氧缺糖/复氧复糖不同时间点小鼠海马神经元细胞系HT22细胞损伤情况.方法 取对数生长期的HT22细胞,随机分为6组:正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖(OGD/R)0 h组(OGD/R 0 h)、缺氧缺糖/复氧复糖12h组(OGD/R 12 h)、缺氧缺糖/复氧复糖24h组(OGD/R 24 h)、缺氧缺糖/复氧复糖48 h组(OGD/R48 h)、缺氧缺糖/复氧复糖72 h组(OGD/R 72 h).除正常对照组外,其余各组细胞均在缺氧缺糖6h后进行复氧复糖.倒置显微镜下观察细胞形态,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞损伤情况,Bax、Bcl-2免疫荧光染色检测细胞凋亡情况.结果 正常组HT22细胞呈两极或多极,突起明显,突起之间相互交织成网状,细胞膜光滑且完整,胞体折光性强,OGD/R各组细胞胞体轴突减少,细胞皱缩,胞质凝聚.与正常组比较,OGD/R各组细胞存活率均显著降低(P＜0.05),OGD/R 12 h至OGD/R 24 h达到低(P＜0.05);OGD/R 12 h及OGD/R 24 h组LDH显著升高(P＜0.05),OGD/R 0 h、48 h、72 h组均有升高趋势.除OGD/R0h组和OGD/R 72 h组外,OGD/R各组Bax/Bcl-2比值均较正常组显著升高(P＜0.05),峰值出现于OGD/R 24 h.结论 缺氧缺糖/复氧复糖细胞损伤是一个复杂的动态过程,随着复氧复糖时间的延长,细胞损伤不断加重,24 h达到顶峰,随后细胞损伤情况逐渐缓解.
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黄芪甲苷通过激活自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡
目的 研究黄芪甲苷通过激活细胞自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导PC12细胞凋亡的作用.方法 取对数生长期的PC12细胞,随机分为7组:正常对照组、模型组、溶媒组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组、自噬激活剂组.除正常对照组外,其余各组剥夺氧、糖3 h后再复氧、复糖12 h,并于复氧、复糖的同时给予相应药物处理.用透射电镜观察自噬小体的变化,Western blot检测LC3-II、Beclin1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)的表达,流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡.结果 与正常对照组相比,模型组出现典型的自噬小体,LC3-II、Beclin1表达均增多(P<0.05),同时Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数也升高(P<0.05).与模型组相比,黄芪甲苷组、自噬激活剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达均增多(P<0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均下降(P<0.05);而自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II 和Beclin1表达减少(P<0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数升高(P<0.05);溶媒组与模型组之间无显著差异(P>0.05).与黄芪甲苷组相比,黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II 和Beclin1表达均减少(P<0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均升高(P<0.05).结论 黄芪甲苷可通过激活细胞自噬而抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡,从而发挥神经保护作用.
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Bcl－2抑制剂对黄芪注射液减轻缺氧缺糖／复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的影响
目的：探讨黄芪注射液（AI）对Bcl－2抑制剂（TW－37）作用下的缺氧缺糖／复氧复糖（H／R）大鼠海马神经元凋亡的影响。方法取原代培养8 d的胎鼠海马神经元，随机分为6组：正常对照组、H／R组、AI组、AI溶剂对照组、Bcl－2抑制剂（TW－37）＋H／R组、TW－37＋AI＋H／R组。除正常对照组外，各组均进行缺氧缺糖0．5 h，再于复氧复糖后七个时间点（0 h、0．5 h、2 h、6 h、24 h、72 h、120 h）分别进行指标检测。采用MTT法检测细胞活性， western blot法和RT－PCR法检测海马神经元Caspase－3蛋白和mRNA的表达。结果与正常对照组比，除0 h外， H／R组海马神经元活性明显降低（P＜0．05），Caspase－3蛋白及Caspase－3 mRNA表达均明显增强（P＜0．05）；与H／R组相比，除0h外，AI组海马神经元活性明显增高（P＜0．05），Caspase－3蛋白及mRNA表达均明显降低（P＜0．05）；而AI溶剂对照组、TW－37＋H／R组及TW－37＋AI＋H／R组则无显著差异（ P＞0．05）。结论黄芪注射液可通过激活Bcl－2抗凋亡机制增强H／R大鼠海马神经细胞活性、降低Caspase－3表达，Bcl－2是黄芪注射液抑制H／R大鼠海马神经元凋亡的重要靶点之一。
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黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的自由基机制
目的 观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影响及其抑制神经元损伤的机制.方法 原代培养8 d的大鼠海马神经元随机分为正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪注射液溶剂对照组和黄芪注射液组.除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5 h再复氧复糖.各组于复氧复糖后0、0.5、2、6、24、48、72 h和120 h测定SOD活力、MDA含量,Western印迹检测caspase-3蛋白的表达,采用原位杂交检测海马神经元caspase-3 mRNA的表达.结果 各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元SOD活性均较正常对照组明显降低(P<0.05),MDA含量升高(P<0.05);与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点SOD的活性、MDA含量无明显变化(P>0.05),而黄芪注射液组在各个时间点SOD的活性明显升高(P<0.05),MDA含量降低(P<0.05).原位杂交结果显示:与正常对照组相比,除0 h和0.5 h之外,缺氧缺糖/复氧复糖组各时间点海马caspase-3阳性神经元数目、占神经元总数的百分率及平均光密度值均明显增多(P<0.05),于24 h达到高峰.黄芪注射液溶剂对照组以上指标的变化趋势与缺氧缺糖/复氧复糖组相一致.黄芪注射液组除0 h和0.5 h之外,各时间点以上指标均比缺氧缺糖/复氧复糖组显著减少(P<0.05).Western印迹检测结果显示:除0 h和0.5 h外,各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元caspase-3蛋白的平均灰度值均较正常对照组明显增加(P<0.05),24 h高;与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点caspase-3蛋白的平均灰度值无明显变化(P>0.05),而黄芪注射液组除0 h和0.5 h外,在各个时间点caspase-3蛋白的平均灰度值明显降低(P<0.05).结论 黄芪注射液可通过减少自由基生成,抑制caspase-3的表达,进而抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的凋亡.
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盐酸戊乙奎醚对大鼠缺氧缺糖/复氧复糖海马脑片凋亡相关因子表达的影响
目的 研究盐酸戊乙李醚(penehyclidine hydrochloride,PHC)对大鼠缺氧缺糖/复氧复糖海马脑片的保护作用及机制.方法 采用大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖模型;分为正常组、缺氧缺糖/复氧复糖(H/R)组、PHC2 μmol/L(PHC2组)、PHC10 μmol/L(PHC10组)、PHC50 μmol/L(PHC50组)、Sco50 μmol/L(Sco50组),测量各组LDH释放率,免疫组织化学法测定各组海马CA1区Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达.结果 PHC各组LDH释放率均较H/R组下降,以PHC50组效果好(P<0.01).PHC50组Bcl-2阳性细胞的表达和Bcl-2/Bax比值均较H/R组升高,Bax和Caspase-3阳性细胞表达均较H/R组降低(P<0.01).Sco50组Bcl-2阳性细胞的表达和Bcl-2/Bax比值也较H/R组升高,Bax和Caspase-3阳性细胞表达均较H/R组降低(P<0.01).结论 PHC可能通过减少LDH释放和Caspase-3、Bax的表达,增加Bcl-2的表达减轻大鼠缺氧缺糖/复氧复糖海马脑片的损伤.
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黄芪甲苷调控自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡
目的 探讨黄芪甲苷通过调控自噬,对缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡的影响.方法 将HT22细胞随机分为正常组(Control)、模型组(Model)、溶剂对照组(DMSO)、黄芪甲苷组(AS-IV)、黄芪甲苷组加正常细胞组(AS-IV+N)、黄芪甲苷加自噬抑制剂组(AS-IV+3-MA)、自噬抑制剂组(3-MA)、自噬激活剂组(Rapa).除正常组外,其余各组细胞均在缺氧缺糖6 h后复氧复糖.镜下观察细胞形态,CCK-8法检测细胞存活率,LDH法检测细胞损伤,免疫荧光染色检测细胞凋亡.结果 与正常组比较,模型组细胞胞体突触减少,细胞皱缩,细胞间连接减少;细胞存活率明显降低,LDH漏出率、Bax/Bcl-2明显升高(P<0.01).与模型组比较,AS-IV组、Rapa组细胞存活率明显升高,LDH漏出率、Bax/Bcl-2明显降低(P<0.01);3-MA组细胞存活率明显降低,Bax/Bcl-2明显升高(P<0.01);AS-IV+3-MA组无明显差异.结论 黄芪甲苷可通过激活自噬,抑制缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡.
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黄芪甲苷对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡的影响
目的：观察黄芪甲苷对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡的影响。方法取对数生长期的PC12细胞,随机分为4组：正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪甲苷组和黄芪甲苷溶剂对照组。其中缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪甲苷组和黄芪甲苷溶剂对照组进行缺氧缺糖3h后再复氧复糖12 h,并于复氧复糖的同时加入黄芪甲苷。用倒置显微镜观察细胞形态, MTT法检测细胞活性, TUNEL染色和Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果正常对照组PC12细胞贴壁生长,呈多角形,突起明显,突起之间交织成网状,细胞膜光滑且完整,胞体折光性较强。与正常对照组相比,缺氧缺糖/复氧复糖组细胞变圆或肿胀,突起回缩或消失,细胞膜破损,胞体折光性差,细胞活性明显下降(P<0．05),细胞凋亡率和凋亡指数明显升高(P<0．05)。与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪甲苷组细胞生长状态见好转,突起较为明显,胞体折光性较好,细胞活性升高(P <0．05),细胞凋亡率和凋亡指数下降(P<0．05)。黄芪甲苷溶剂对照组与缺氧缺糖/复氧复糖组相比无明显差异(P>0．05)。结论黄芪甲苷可减轻缺氧缺糖/复氧复糖引起的PC12细胞损伤,提高细胞活性,抑制细胞凋亡。
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黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元JNK3的表达
目的 观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关蛋白c-Jun氨基末端激酶3(c-Jun N terminal kinase 3,JNK3)及其mRNA表达的影响,探讨黄芪注射液防治海马神经元凋亡可能的作用机制.方法 取原代培养8 d的大鼠海马神经元,随机分为4组:正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪注射液组和黄芪溶剂对照组.其中缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪注射液组和黄芪溶剂对照组进行缺氧缺糖0.5 h再复氧复糖,并于复氧复糖后0、0.5、2、6、24、72和120 h采用Western blot、ELISA和RT-PCR方法检测海马神经元JNK3蛋白及其mRNA的表达.结果 缺氧缺糖/复氧复糖组在0、0.5、2、6、24和72 h海马神经元JNK3蛋白条带平均光密度值及蛋白活性均较正常对照组增加(P<0.05),而复氧复糖120 h组较正常对照组降低(P<0.05);与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,除120 h之外,黄芪注射液组在各个时间点JNK3蛋白条带的平均光密度值及蛋白活性均降低(P<0.05);而黄芪溶剂对照组与缺氧缺糖/复氧复糖组相比则差异无显著性(P>0.05).缺氧缺糖/复氧复糖组在0、0.5、2、6、24、72和120 h海马神经元JNK3 mRNA平均光密度值均较正常对照组增加(P<0.05);与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,除120 h之外,黄芪注射液组在各个时间点JNK3 mRNA的平均光密度值均降低(P<0.05);而黄芪溶剂对照组与缺氧缺糖/复氧复糖组相比则差异无显著性(P>0.05).结论 黄芪注射液可抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关基因JNK3 mRNA表达,从而抑制JNK3蛋白表达,降低了JNK3蛋白活性,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖引起大鼠海马神经元凋亡的作用.
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黄芪甲苷对缺氧缺糖／复氧复糖PC12细胞TLR4通路的影响
TLR4受体已经被证明在脑缺血中发挥着关键的作用［1］。黄芪甲苷可明显减轻大鼠脑缺血／再灌注损伤中的脑梗死面积，抑制神经细胞凋亡［2］。黄芪甲苷是否通过TLR4／MyD88通路来抑制细胞凋亡？本文以PC12细胞为实验对象，研究黄芪甲苷对缺氧缺糖／复氧复糖PC12细胞TLR4通路的影响，探讨黄芪甲苷抑制细胞凋亡的作用机制。
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缺氧缺糖/复氧复糖对大鼠皮质及海马神经元ClC-3氯离子通道表达的影响
目的:研究原代培养大鼠前额叶皮质和海马神经元缺氧缺糖/复氧复糖后电压门控氯离子通道3(voltage-gated chloride channel 3,ClC-3)在mRNA和蛋白水平的表达.方法:取原代培养8d的大鼠皮质和海马神经元,随机分为对照组和模型组.模型组缺氧缺糖30 min后再复氧复糖,于复氧复糖后6、24、48、72 h采用反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)、Western blot技术检测ClC-3 mRNA及蛋白水平的表达.结果:原代培养大鼠皮质和海马神经元ClC-3 mRNA及蛋白水平呈低水平表达.缺氧缺糖/复氧复糖24 h后培养皮质神经元ClC-3mRNA及蛋白水平开始上调,48 h仍然高表达,72 h后下降(P＜0.05).海马神经元ClC-3 mRNA在缺氧缺糖/复氧复糖6h后即开始升高,高峰持续从24～48 h(P＜0.05),72 h下降至略高于正常水平(P＜0.05).海马神经元ClC-3蛋白在24h后表达开始逐渐升高,至72 h仍高表达(P＜0.05).结论:C1 C-3通道表达上调可能增强复氧复糖后细胞对氧化应激、炎性反应的同时也促进细胞凋亡.
关键词： 电压门控氯离子通道3 额叶皮质 海马 缺氧缺糖/复氧复糖 大鼠
