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丹皮酚对高血压病血瘀证患者血清干预的人脐静脉内皮细胞膜联蛋白Ⅴ与肌动蛋白结合的影响
目的:研究丹皮酚对高血压病血瘀证患者血清损伤后的血管内皮细胞(VEC)的膜联蛋白Ⅴ与肌动蛋白结合的表达的影响,进一步探讨丹皮酚保护VEC的作用机制.方法:运用CCK-8法检测丹皮酚不同浓度25、50、100、250、500、1 000mg/L对人脐静脉内皮细胞活性的影响;选用250mg/L浓度的丹皮酚预干预细胞模型,运用免疫印记杂交技术检测丹皮酚组与对照组膜联蛋白Ⅴ与肌动蛋白结合的表达.结果:丹皮酚不同浓度对细胞活性的影响:不同浓度组之间比较,差异无统计学意义.250mg/L丹皮酚干预后对与肌动蛋白结合的膜联蛋白Ⅴ表达的影响:模型对照组、丹皮酚组与肌动蛋白结合的膜联蛋白Ⅴ的表达逐渐降低,其中每组与肌动蛋白结合的膜联蛋白Ⅴ的表达呈现血瘀证组、非血瘀证组、正常组逐渐降低的趋势.血瘀证组,丹皮酚组与模型对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:丹皮酚具有保护人脐静脉内皮细胞完整性的作用,其机制可能是通过降低肌动蛋白G/F含量比值的方式,减少膜联蛋白Ⅴ与肌动蛋白的结合,促进肌动蛋白的重装.
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99mTc-Annexin Ⅴ兔静脉血栓显像
目的 探讨采用99mTc-膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)进行静脉血栓显像的可行性.方法 将10只家兔随机分为血栓组及对照组,每组5只.血栓组通过手术于下腔静脉置入螺旋铜丝,建立静脉血栓模型;对照组手术过程与造模术相同,但不置入铜丝.术后1天对两组实验兔注射99mTc-Annexin Ⅴ进行显像,分别于注射后30、60、90 min及2h行静态平面显像,勾画ROI,血栓组分别计算血栓部位与本底、血栓头侧下腔静脉部位放射性计数比值,对照组分别计算与血栓组血栓段对应的下腔静脉部位与本底、头侧下腔静脉部位放射性计数比值.处死动物,血栓组取血栓称重、测量放射性计数,计算每克组织百分注射剂量率(％ ID/g),行HE染色.结果 血栓组5只实验兔可于血栓部位观察到放射性浓聚,对照组下腔静脉未见放射性浓聚.血栓组血栓与本底、血栓与头侧下腔静脉部位放射性计数比值(4.06±0.49、1.62±0.26)高于对照组(2.27±0.24、0.96±0.05;t=7.32、5.63,P均＜0.05),血栓百分注射剂量率为[(0.0189±0.0022)％ID/g],病理显示为新鲜混合血栓.结论 99mTc-Annexin Ⅴ有望成为一种新的静脉血栓显像剂.
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人膜联蛋白Ⅴ在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定
目的:构建人膜联蛋白Ⅴ的原核载体并诱导其表达.方法:以IPTG诱导His融合人膜联蛋白Ⅴ的表达,并应用Ni-NTASuperflow纯化.结果:PCR扩增产物碱基数量与目的片段大小一致,插入片段的序列与发表的人膜联蛋白Ⅴ基因编码序列一致.在IPTG诱导下,重组大肠杆菌DH5α高效表达分子量约36 kDa的目的产物.结论:人膜联蛋白Ⅴ编码序列已被克隆至His融合表达载体pET-28a(+)上,并在大肠杆菌DH5α中表达.
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应用免疫荧光双标记染色技术检测乙型肝炎病毒感染胎盘膜联蛋白Ⅴ的表达
背景:膜联蛋白Ⅴ是近年来被作为肝细胞膜上存在的与乙型肝炎病毒感染相关受体研究的热点之一,并在胎盘组织中也有表达.目的:探讨膜联蛋白Ⅴ在HBV宫内感染中的作用;揭示HBV进入胎盘组织细胞的方式,为HBV的宫内感染的机理提供理论依据.设计:随机对照实验.单位:泰山医学院.对象:选择2003-01/2004-12济南市妇幼保健院、泰安市中心医院、泰安市妇幼保健院收集的30例HBsAg阳性孕妇足月分娩的胎盘组织,同时收集母血分离血清.实验经过孕妇知情同意及医院伦理委员会批准.兔抗人膜联蛋白Ⅴ亲和纯化抗体(第一抗体)、鼠抗人HBs mAb(第一抗体)、生物素化羊抗小鼠IgG(第二抗体)均购自武汉博士德生物工程有限公司.方法:用即用型SABC免疫组织化学染色试剂,检测30例HBsAg阳性的足月胎盘组织中,有18例检测到HBsAg,随机选取10例进行荧光双标染色,其染色主要过程为将待测石蜡切片标本常规脱蜡至水;抗原微波热修复;加入第一种一抗(兔抗人AnV亲和纯化抗体1:60,为单克隆抗体)置湿盒中,4 ℃冰箱过夜;第二种一抗(鼠抗人HBs mAb1:50),置湿盒中,4 ℃冰箱过夜;加入与第二种一抗相应的二抗(如生物素化的羊抗鼠IgG1:100);加入以PBS作适当稀释的第一种荧光抗体(如FITC-羊抗兔IgG1:50);加入第二种荧光抗体(Avidin-Cy3);缓冲甘油封固;激光共聚焦显微镜下观察并进行图像分析.用IPP4.5图像分析法,先进入IPP4.5系统的Image Analysis程序,然后调入分析文件进行分析.主要观察指标:乙型肝炎病毒感染的胎盘组织中HBsAg/膜联蛋白:Ⅴ的存在与分布情况.结果:选取10例进行荧光双标染色结合激光共聚焦显微镜检测胎盘组织上滋养层细胞乙型肝炎病毒/膜联蛋白Ⅴ的存在与分布模式.胎盘组织中存在着丰富的膜联蛋白Ⅴ,位于绒毛合体滋养层细胞,在基质细胞和血管内皮细胞都有膜联蛋白Ⅴ的表达.并发现在同一细胞中存在着乙型肝炎病毒和膜联蛋白Ⅴ的共存现象.结论:乙型肝炎病毒感染胎盘细胞可能是通过与细胞上的受体膜联蛋白Ⅴ结合,促使病毒进入胎盘细胞,导致宫内感染.
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孕妇外周血中annexin Ⅴ的表达及其与子痫发病的相关性研究
目的:探讨孕妇外周血中膜联蛋白Ⅴ(annexin Ⅴ)的表达及其与子痫发病的关系.方法:选择2009年10月～2011年10月子痫前期孕妇120例为研究对象,包括轻度子痫前期60例(轻度组)和重度子痫前期60例(重度组),另选同期健康孕妇60例为健康对照组.采用蛋白质印迹法测定所有孕妇外周血膜联蛋白Ⅴ的水平,并对所有孕妇外周血凝血功能进行检测.结果:轻度组、重度组和健康对照组外周血膜联蛋白Ⅴ的水平分别为(0.80±0.08)、(0.72±0.16)和(1.68±0.26),轻度和重度子痫前期组水平均明显低于健康对照组(P＜0.05),但轻度和重度子痫前期组差异无统计学意义(P＞0.05).外周血凝血功能各项指标子痫前期各组与健康对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论:子痫前期孕妇外周血膜联蛋白V的表达水平降低,但其表达水平与病情的严重程度无关.
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母体血浆中Annexin Ⅴ、ET-1、vWF在子痫前期患者中的表达及意义
目的:研究子痫前期患者外周母体血浆中Annexin Ⅴ、ET-1、vWF的表达水平及其相关性,并探讨子痫前期发病机理.方法:采用ELISA方法检测子痫前期患者84例(轻度29例、早发重度型27例、晚发重度型28例)及同期无内外科合并症、因产科和社会因素行剖宫产健康产妇(对照组)29例母体外周血浆中Annexin Ⅴ、ET-1、vWF的表达水平,并检测其相关性.结果:①外周血中Annexin Ⅴ水平在轻度组、早发重度组、晚发重度组及对照组的表达分别为(0.81 ±0.12)、(0.49 ±0.11)、(0.72±0.13)、(1.31±0.19) ng/ml,子痫前期各组与对照组差异均有统计学意义(P＜0.01),早发重度组与轻度组及晚发重度组比较差异均有统计学意义(P＜0.01),但轻度组与晚发重度组比较差异无统计学意义(P＞0.05).②外周血中ET-1在轻度组、早发重度组、晚发重度组及对照组的表达分别为(26.74 ±5.33)、(17.73±6.13)、(36.16±7.66)、(42.25 ±8.84) ng/ml,子痫前期各组与对照组差异均有统计学意义(P＜0.01),子痫前期患者各组间随病情加重ET-1水平升高差异有统计学意义(P＜0.05).③外周血中vWF在轻度组、早发重度组、晚发重度组及对照组的表达分别为(92.22±10.66)、(126.14±14.59)、(118.29±10.62)、(103.29 ±9.99) ng/ml,子痫前期各组vWF浓度与对照组差异均有统计学意义(P＜0.01),子痫前期轻度组、早发重度组及晚发重度组两两分别比较差异有统计学意义(P＜0.05).④子痫前期各组孕妇外周血中AnnexinⅤ与ET-l的表达均呈明显负相关(P＜0.01),Annexin Ⅴ与vWF的表达均呈明显负相关(P＜0.05),vWF与ET-1的表达均呈明显正相关(P＜0.01).结论:母体外周血浆中Annexin Ⅴ、ET-1、vWF的表达可能与子痫前期发病机制有关,且3种因子相互影响,通过影响胎盘中凝血-纤溶系统及血管内皮系统参与子痫前期发生、发展的病理生理过程.
关键词： 子痫前期 膜联蛋白Ⅴ 内皮素1 血管性假血友病性因子 -
乳腺癌SPECT分子显像靶点基础研究进展
近年来乳腺癌的分子显像水平逐渐进步,更多特异性的显像靶点被发现.本文对比了几组基础实验较为成熟的乳腺癌SPECT分子显像靶点:小鼠双微体扩增基因(Murine double minute2,MDM2)、磷酸化组蛋白(Phosphorylated H2AX,γH2AX)、膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)、表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)、人表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)等.并综述了这些靶点及显像技术的研究现状,为乳腺癌SPECT分子显像的发展奠定基础.
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99Tcm-His10-Annexin Ⅴ探测非小细胞肺癌细胞凋亡的实验研究
目的 探讨99Tcm标记带有10个连续组氨酸的膜联蛋白Ⅴ(His10-Annexin Ⅴ)探测荷非小细胞肺癌(NSCLC)裸小鼠模型化疗后肿瘤细胞凋亡的可行性.方法 用99Tcm直接标记His10-Annexin Ⅴ.荷H460 NSCLC肿瘤裸小鼠模型20只,按体表面积以100 mg/m2剂量紫杉醇化疗诱导,分成未治疗(对照)、化疗诱导后24,48,72 h共4组.99Tcm-His10-Annexin Ⅴ显像探测化疗前后肿瘤组织细胞凋亡,计算肿瘤/对侧正常肌肉组织放射性比值(T/NT),测定每克组织百分注射剂量率(%ID/g).以99Tcm-IgG显像为对照,确定肿瘤的非特异性摄取.用流式细胞术(FCM)测定肿瘤组织活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-3),光学显微镜HE及原位末端标记法(TUNEL)染色测定凋亡指数.采用SPSS 12.0软件进行统计学处理,运用单因素方差分析和直线相关分析(Pearson).结果 99Tcm-His10-Annexin V放化纯为(98.01±1.67)%.注射99Tcm-His10-Annexin V后2 h即可得到清晰图像,化疗诱导组肿瘤部位可见明显的放射性浓聚,化疗后24,48,72 h组的T/NT值分别为2.63±0.76,3.41±0.90,3.85±0.62;对照组T/NT值为1.42±0.19,F值分别为12.064,23.322,70.177,P均<0.01.未治疗组肿瘤仅有少量放射性摄取,为(1.09±0.18)%ID/g,化疗后肿瘤摄取明显增加,24,48,72 h肿瘤摄取分别为(2.55±0.73)、(3.60±1.09)、(3.73±0.97)%ID/g,明显高于未治疗组(F值分别为18.733,20.624,35.626,P均<0.01).99Tcm-IgG显像化疗组及对照组肿瘤均未见明显放射性浓聚.未治疗组活化Caspase-3为(3.70±0.74)%,化疗后24,48,72 h分别为(23.46±2.23)%、(62.85±6.13)%、(70.44±6.09)%,3个化疗诱导组和未治疗组相比差异均有统计学意义(F值分别为354.610,459.438,591.052,P均<0.01).光学显微镜HE及TUNEL染色法发现,未治疗组细胞凋亡指数为(3.31±0.61)%,化疗后24,48,72 h细胞凋亡指数分别为(32.90±6.64)%、<70.42±7.54)%、(83.23±9.71)%,化疗诱导组与对照组细胞凋亡指数差异均有统计学意义(F值分别为98.627,393.215,337.386,P均<0.01).T/NT值、肿瘤组织放射性摄取与活化Caspase-3及细胞凋亡指数均有很好的相关性(r=0.847,0.833,0.774,0.850,P均<0.01).结论 99Tcm-His10-Annexin V显像可早期探测NSCLC化疗后细胞凋亡,进而早期预测和评价肿瘤治疗疗效.
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单次化疗后肿瘤99Tcm-rh-Annexin Ⅴ分布与Survivin、Caspase-3蛋白表达的相关性研究
目的 评价99Tcm-重组人膜联蛋白Ⅴ(rh-Annexin Ⅴ)显像检测单次化疗后肿瘤细胞凋亡的可行性,探讨其在肿瘤组织的分布与凋亡调控蛋白Survivin、Caspase-3表达的相关性.方法 采用99Tcm直接标记法标记rh-Annexin Ⅴ,作为核素凋亡显像剂.将小鼠肝癌细胞Hca-F25接种于小鼠右腋窝皮下;区组随机化分为A(对照组,9只)和B(化疗组,10只)组,肿瘤生长至直径约1 cm时,B组一次性接受环磷酰胺腹腔内注射,剂量为按体质量150 mr,/kg,A组注射同体积生理盐水;20 h后2组同时由鼠尾静脉注入99Tcm-rh-AnnexinⅤ;4 h后行SPECT显像并处死、取肿瘤组织,用井型γ闪烁计数器检测荷瘤小鼠肿瘤组织内放射性分布,以每克组织百分注射剂量率(%ID/g)表示.采用原位末端标记法(TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡;采用免疫组织化学SP法检测标本中Survivin、Caspase-3蛋白表达.采用SPSS 10.0软件对数据进行统计学处理.结果 单次化疗后B组肿瘤组织内99Tcm-rh-Annexin Ⅴ分布[(0.478±0.123)%ID/g]、TUNEL检测阳性细胞数[(18.030±5.600)个/视野]及caspase-3蛋白表达[(3.266±0.482)%]均明显高于A组[分别为(0.332±0.061)%ID/g,(6.744±2.325)个/视野,(2.387±0.387)%],A组Survivin蛋白表达[(4.227±0.636)%]明显高于B组[(3.407±0.519)%],差异有统计学意义(F值依次为10.502,31.507,18.971,9.560,P均＜0.01).相关性研究表明,肿瘤组织的放射性摄取(%ID/g)与TUNEL阳性细胞数呈明显正相关(r=0.858,P=0.000);肿瘤组织内Survivin蛋白表达与Caspase-3蛋白表达呈明显负相关(r=-0.818,P=0.000);肿瘤组织内99Tcm-rh-Annexin Ⅴ分布与Caspase-3蛋白表达呈明显正相关,与Survivin蛋白表达呈明显负相关(P＜0.01).结论 肿瘤组织内99Tcm-rh-AnnexinⅤ的分布可以反映化疗后早期肿瘤组织细胞凋亡的状况以及Survivin、Caspase-3表达水平的变化.
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99Tcm标重组H-Annexin Ⅴ在动物血栓显像中的研究
目的 评价人膜联蛋白Ⅴ(H-Annexin Ⅴ)对血栓的亲和性,对99Tcm直接标记H-Annexin Ⅴ与通过联肼尼克酰胺(HYNIC)螯合标记Annexin Ⅴ进行比较.方法 在3种不同的反应条件下,分别用99TcO4-直接标记Annexin Ⅴ、H-Annexin Ⅴ及HYNIC-Annexin Ⅴ,然后测定标记率、稳定性及对兔股动脉血栓模型进行γ显像,比较损伤侧(T,血栓)及对侧(NT)的放射性比值.结果 在还原剂足量的情况下,99TcmO4-直接标记H-Annexin Ⅴ方法简便,反应条件易于控制,99Tcm-H-Annexin Ⅴ标记率达95%以上,17 h后测放化纯仍＞80%,血栓显像示动脉损伤处有明显的放射性浓聚,损伤处平均放射性计数为健侧放射性计数的3.714倍.结论 99Tcm-H-Annexin Ⅴ与血栓具有很好的亲和力,标记率及稳定性高,标记方法较为简单.
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99Tcm-Annexin Ⅴ衍生物的制备及其生物分布和凋亡显像
目的 探讨99Tcm直接标记带有10个连续组氨酸的膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)衍生物的可行性,研究其在健康小鼠体内的分布和肺癌裸鼠模型凋亡显像.方法 直接标记法制备99Tcm-Annexin Ⅴ衍生物,并测产物放化纯、胶体含量及健康小鼠体内不同时间点(5,30 min和1,2,4,6,12,24 h)的生物分布,DAS 2.0软件拟合计算药代动力学参数.建立荷H460非小细胞肺癌裸鼠模型,分为紫杉醇诱导化疗组(5只)和未治疗对照组(5只).紫杉醇诱导化疗后48 h,于裸鼠尾静脉注射99Tcm-Annexin Ⅴ衍生物18.5 MBq,2和4 h时进行凋亡显像,勾画ROI并计算肿瘤与对侧正常组织(T/NT)放射性比值.结果 放化纯达(98.01±1.67)%,3 h后放化纯仍可达(95.45±1.34)%,胶体含量为(3.31±1.37)%.健康小鼠体内分布实验表明肾脏对该示踪剂摄取高,肝、脾摄取较少.DAS 2.0软件拟合得到时间-放射性曲线符合二室模型特征,分布相半衰期(T1/2α)为(21.18±5.95)min,清除相半衰期(T1/2β)为(69.32±0.10)min.荷瘤鼠显像示,给药后2 h即可获得清晰的图像,紫杉醇诱导化疗组2和4 h的T/NT比值为3.85±1.10和4.63±0.97,明显高于对照组(1.60±0.29和1.71±0.43,P＜0.01).结论 该Annexin Ⅴ衍生物易于99Tcm直接标记,方法简便,标记物在血液中清除迅速,肝、脾摄取少,易得到高清晰图像.
