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托品烷生物碱生物合成与代谢工程研究进展
托品烷生物碱是医药史上古老的一类药物,常用的有莨菪碱(或其外消旋体阿托品)和东莨菪碱,它们都具有显著的抗胆碱活性,在现代临床上应用相当广泛.目前,市场上托品烷生物碱的供应完全依赖植物提取,但药源植物中生物碱含量往往较低,培育高含量托品烷生物碱的药源植物成为领域内共同追求的目标,利用生物技术提高发根或植株中托品烷生物碱含量成为次生代谢领域的研究热点.近10年来,托品烷生物碱的生物合成分子生物学研究取得了重要进展,代谢工程也获得了大量研究成果,本文对这两方面的研究进展进行综述,并对存在的关键问题和未来研究方向进行分析和展望.
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酵母提取物对颠茄毛状根氮代谢及次生代谢影响的机制探究
以颠茄毛状根为试验材料,向培养基中添加酵母提取物(yeast extract,YE),测定颠茄毛状根氮代谢关键酶的活性,各形态氮的含量,次生代谢前体物质含量,次生代谢途径中关键酶基因相对表达量以及主要托品烷类生物碱(tropane alka-loids,TAs)莨菪碱和东莨菪碱的产量,初步探究YE诱导合成颠茄毛状根次生代谢产物的机制.结果表明:较对照组而言,氮代谢关键酶硝酸还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)活性显著升高,谷氨酸脱氢酶(GDH) 活性变化不显著.硝态氮,铵态氮含量显著下降,而可溶性蛋白,游离氨基酸,总氮含量均显著升高.此外,YE处理颠茄毛状根提高了次生代谢途径中的前体氨基酸(鸟氨酸和精氨酸) 的含量以及代谢前体腐胺的含量,3个关键酶基因1,4-丁二氨-氮-甲基转移酶基因(putrescine N-methyl transferase,pmt) 、托品酮还原酶-Ⅰ基因(tropinone reductase-Ⅰ,trI)和莨菪碱6-β-羟化酶基因(hyoscyamine 6-β-hydrox-ylase,h6h)的相对表达量也呈现不同幅度的上升,终导致莨菪碱和东莨菪碱产量的增多,在处理16 d后分别是对照组的3. 09,1. 85倍.这说明YE诱导氮代谢关键酶活性升高使氮代谢加速,为次生代谢中含氮化合物的合成提供更多原料,同时通过调控次生代谢途径中关键酶基因的表达,使莨菪碱和东莨菪碱产量提高.
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天仙子中参与托品烷生物碱生物合成的ArAT基因的克隆及功能鉴定
托品烷类生物碱是临床上广泛应用的抗胆碱药物,其生物合成涉及到苯丙氨酸的转氨基反应.根据天仙子(Hyoscyamus niger)侧根和叶的转录组数据,筛选到3条功能注释为芳香族氨基酸氨基转移酶的基因,命名为HnArAT1、HnArAT2和HnArAT3.通过序列同源性分析,发现HnArAT3与颠茄的AbArAT4的氨基酸序列同源性高,两者为直系同源.组织表达谱显示,HnArAT3基因在根中特异性表达,与其他3个合成途径基因(PMT、TRI和H6H)表达模式相同.用病毒诱导的基因沉默(VIGS)方法在天仙子植株中鉴定HnArAT3的功能,对感染了病毒的植株,用实时荧光定量PCR检测基因的表达量,HPLC法测定托品烷类生物碱的含量.结果表明,在pTRV2-HnArAT3干扰的植株中,HnArAT3基因的表达量有显著下降,3种托品烷类生物碱莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量也有显著的降低.以上结果表明HnArAT3是天仙子中参与托品烷类生物碱生物合成的苯乳酸支路途径基因.HnArAT3基因的克隆为进一步研究托品烷类生物碱的生物合成和代谢调控奠定了基础,也为开展托品烷类生物碱的代谢工程研究提供了新的候选靶基因.
关键词： 天仙子 芳香族氨基酸氨基转移酶 病毒诱导的基因沉默 托品烷类生物碱 -
托品烷类生物碱生物合成分子生物学与代谢工程
莨菪碱和东茛菪碱属于托品烷类生物碱,是重要的抗 胆碱类药物.托品烷类生物碱生物合成分子生物学和代谢工程一直是植物次生代谢工程研究的热点.随着植物功能基因组学和代谢组学的发展,托品烷类生物碱生物合成研究取得重要进展.重点对托品烷类生物碱生物合成途径、功能基因和代谢工程研究进展进行综述,并对可能存在的问题以及应用前景进行展望.
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HPLC法测定华山参滴丸中东莨菪碱、阿托品及东莨菪内酯的含量
目的:建立HPLC法测定华山参滴丸中东莨菪碱、阿托品及东莨菪内酯的含量.方法:采用资生堂CAPCELL - PAK C18(4.6 mm ×250 mm,5 μm)色谱柱,以乙腈-甲醇-磷酸氢二钠缓冲液(15:4:81)为流动相,流速1.0mL·min-1,东莨菪碱、阿托品检测波长210 nm(0～15 rin),东莨菪内酯检测波长为344 nm(15.1 ～30 min),柱温30℃.结果:东莨菪碱、阿托品及东莨菪内酯的线性范围分别为0.04 ～3.95,0.04 ～4.10,0.05～0.54 μg(r =0.9999)；平均回收率(n=6)分别为97.58％(R SD=1.3％),98.65％( RSD =1.3％),98.42％( RSD=1.8％).结论:本文方法简便、准确,可以用于华山参滴丸中东莨菪碱、阿托品及东莨菪内酯的含量测定.
