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异源双链泳动分析法快速检测TT病毒基因型
目的建立一种简单、敏感、特异和成本低的TT病毒(TTV)基因型测定方法.方法采用巢式聚合酶链反应方法(nPCR)对96名正常人和180例各型肝炎患者血清标本进行TTV DNA检测,然后采用异源双链泳动分析法(HMA)和序列测定分析法对TTV DNA阳性标本进行基因分型.结果各型病毒性肝炎中TTV DNA阳性率为22.2%(40/180),正常人为19.8%(19/96),两者差异无显著性(χ2=0.220,P=0.639).在甲、乙、丙、戊型肝炎和非甲～戊型肝炎患者中TTV DNA 阳性率分别为20.0%(6/30)、16.7%(5/30)、23.3%(7/30)、36.7%(11/30)和18.3%(11/60).在40例TTV DNA阳性标本中,经HMA法分型,G1型为50.0%(20/40),G2型为17.5%(7/40),混合型为25.0%(10/40),另有7.5%(3/40) 未能分型.10例TTV混合型感染的标本经克隆测序及基因进化树分析,5例为G1和G2型, 2例为G1和G3型,1例为G1和G4型,1例为G2和G3型,1例为G1、G2和G3混合型感染.结论 HMA是一种简单、敏感、特异和经济的分型法,可用于TTV基因型分型.
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血浆置换患者TT病毒感染的观察
目的 研究血浆置换患者人群中经输血传播TT病毒的感染状况及临床意义.方法 用聚合酶链反应(PCR)方法检测45例血浆置换患者和慢性肝炎患者的TT病毒(TTV)感染情况,分析TTV感染的致病力.结果 TTV在45例血浆置换患者中的感染率为15.6%(7/45),在87例慢性肝炎患者中的感染率3.4%(3/87),经统计学处理,两组感染率比较差异有显著性(χ2＝4.60,P＜0.05).7例TTV阳性患者中,6例有输血史.且TTV阳性和TTV阴性两组之间病死率差异无统计学意义.结论 输血、血浆在传播TTV感染有重要意义,TTV是否导致或促进重型肝炎肝衰竭的因素,有待深入研究.
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闽南地区TT病毒的变异及经输血传播的初步证据
TT virus(TTV)DNA was tested by nested-PCR from sera of hepatitis patients and volunteer blood donors in Minnan area. The amplified segment was a 189 base pair region in TTV ORF2. A total of six sequences were obtained from three non-A to G hepatits patients and two from volunteer blood donors. The sequences were found to be with 82.9% to 99.3% homology to TTV Japanese strain and Chinese strain. The divergence of sequence in these six segments varied from 0.7% to 17.1%, which indicated that the TTV had been existing for a long time in this area. In the serum of a non-A to G hepatitis patient who was negative for TTV DNA in the 14th day of disease course turned to be positive in the 30th day, two TTV sequences were obtained which showed 92.1% nucleotide homology. It indicated that different TTV strains can co-exist in the same person. This patient's blood had been transfused ten times between the collection of his TTV negative sample and his positive serum sample. Seven of the blood donors were traced and sampled for sera, of which three were positive for TTV. For all 161 patients tested, the history of exposure to blood products was associated with an increased risk of TTV infection(relative risk, 3.0; 95% confidence intervals, 1.89～4.81).
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地高辛标记探针原位杂交法检测肝病患者外周血单个核细胞中TTV-DNA
为检测肝病患者外周血单个核细胞(PBMC)中TTV-DNA(输血传播病毒脱氧核糖核酸), 以TTV ORF1为模板, 应用地高辛(Dig)作为标记物, 经聚合酶链反应(PCR)制备探针, 建立原位杂交方法进行检测.结果显示: 血清TTV-DNA阳性组, 双链探针检测PBMC中TTV-DNA, 阳性检出率为58.06%(18/31); 血清TTV-DNA阴性组, 双链探针检测PBMC中TTV-DNA, 阳性检出率为27.59%(8/29).双链探针阳性者, 再以负链探针检测其复制情况, 阳性率为22.2%(4/18). 结论: TTV可感染PBMC并在PBMC中复制.
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特异核酸捕获-PCR技术在从高背景标本中检测TT病毒DNA的应用
目的解决因TTV在样本中的水平极低而导致从高背景核酸样本中检测TTV DNA存在非特异性扩增的问题。方法采用亲和素生物素系统将TTV特异的核酸片段包被在微孔板上，利用特异核酸捕获样本中的TTV DNA，从而建立特异核酸捕获-PCR检测TTV DNA方法，并以10份血清(4份TTV DNA阳性)和肝组织配对标本为对象与抽提法进行比较，阳性产物进行DNA序列分析，后评价特异核酸捕获-PCR的特异性。结果抽提法在血清和肝组织中的检出率分别为4/10和9/10。RFLP初步分析产物具有特异性，但经DNA序列分析证实的检出率仅分别为2/10和3/10。采用特异核酸捕获-PCR检测的结果与抽提法经DNA序列分析后的结果一致，获得的电泳条带也更为清晰。结论特异核酸捕获-PCR方法能显著提高TTV DNA检测的特异性，特别是针对高背景核酸标本，表明该方法在其他低水平病原体检测及高背景核酸样本检测中也有广泛的应用前景。目前广泛采用的TTV DNA检测方法如不进行DNA序列分析则可导致过高地估计了TTV的感染率。
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TTV酶联免疫方法的建立及其初步应用
目的建立检测TTV的酶免疫技术，了解不同型肝炎患者血清中抗-TTV抗体的分布情况，并结合TTV DNA的检测分析两者的关系。方法 以原核表达的TTV ORF1蛋白为抗原建立检测抗-TTV的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，采用该方法检测不同肝炎患者中抗-TTV抗体；以套式聚合酶链反应(PCR)方法检测血清标本中TTV DNA。结果 所建立的检测TTV的ELISA方法具有较好的特异性，不同型别肝炎患者中抗-TTV抗体阳性率分别为：甲型肝炎患者10.5%(4/38)，乙型肝炎患者12.5%(16/128)，丙型肝炎患者8.3%(7/84)，丁型肝炎患者7.7%(1/13)，戊型肝炎患者12%(3/25)，庚型肝炎患者6.5%(4/62)，非甲～庚型肝炎患者32.3%(30/93)，健康人群1.3%(1/78)。统计学分析表明，非甲～庚型肝炎患者抗-TTV阳性率显著高于其他型肝炎患者(P<0.01)，而正常人群则显著低于肝炎患者(P<0.05)。抗-TTV阳性率与TTV DNA阳性率存在相关性(P<0.05)。结论 在不同型肝炎患者中均可检出抗-TTV抗体，但以非甲～庚型肝炎患者阳性率高；TTV抗体可与基因同时存在于患者血清中，抗-TTV抗体可能类似抗-HCV，是一传染性标志。
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7株TT病毒部分核苷酸及氨基酸序列分析
目的了解TT病毒(Transfusion transmitted virus,TTV)在我国的流行情况,研究我国TTV株序列特点.方法采用半巢式聚合酶链反应(PCR)扩增TTV DNA,PCR阳性扩增产物直接测序.结果我国7例TTV DNA株部分序列与日本株相比,核苷酸及氨基酸同源性分别为64.7%～98.4%及62.7%～96.4%;7株间的核苷酸及氨基酸同源性分别为63.5%～98.4%及60.2%～96.4%,分别属于两种型及其中一型中的两种亚型.结论我国存在TTV并可能存在多种TTV基因型.
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原位杂交法检测非甲～庚型肝炎患者肝组织中TT病毒DNA
目的证实在非甲～庚型病毒性肝炎患者肝组织中TT病毒(transfusion-transmittedvirus，TTv)的存在。方法采用地高辛素标记TTV DNA探针以原位杂交技术对51例血清学病毒标记非甲～戊型、免疫组化检测肝组织中HBsAg、HCV NS3Ag及HGV NS5Ag阴性的病毒性肝炎患者石蜡包埋肝组织进行了检测。结果各型病毒性肝炎肝组织中TTV基因的总检出率为27.5％，其中急性轻型肝炎的检出率为30.8％(4/13)，急性重型肝炎为1/8，亚急性重型肝炎为3/7，慢性肝炎为2/6，活动性肝硬化为2/9，慢性重型肝炎为1/4，原发性肝癌为1/4。TTV DNA表达于肝细胞核或胞质内，以核型多见。在急性肝炎，TTV阳性细胞弥漫分布于肝小叶内，慢性肝炎于汇管区附近较为密集，而在肝硬化病例，阳性细胞在假小叶内多呈片簇状不规则分布。结论在不明原因病毒性肝炎患者血清及肝组织中TTV DNA的检出表明TTV为一种新型的肝炎病毒，TTV为一种嗜肝性病毒。
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一种新的TTV基因群全基因序列测定及基因结构分析
目的测定2株TTV高度变异株全基因序列,对其基因结构、基因分型及分子流行病学分析. 方法从2名感染TTV高度变异株的婴儿血清中抽提其DNA,用long inverted PCR扩增出全基因组并测定其序列,同时对测序结果进行分析.根据测定的序列设计引物,对人群中此类变异株的感染情况进行研究. 结果首次报道了TTV一个新基因群--第5基因群;测定了该基因群中2株变异株的全基因序列.该基因群在小于30日龄、1～6月龄、7～12月龄的婴儿中检出率分别为0、27.3%、39.5%,献血员中检出率为45.8%. 结论虽然第5基因群基因组核酸序列呈高度异质性,但其基本结构及功能与已报道的TTV各基因群十分相似;婴儿中该基因群的感染主要与环境因素有关.
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TT病毒与肝炎关系的临床流行病学研究
目的 对闽南地区各种肝炎患者、健康体检者、义务献血员和肝癌患者共480例从临床流行病学角度探讨TT病毒(TTV)的致病性及其与各种肝炎的关系.方法 采用巢式PCR检测血清TTV DNA、 ELISA检测血清抗HAV IgM、 HBsAg、抗HBc IgM、抗HCV IgG、抗HEV IgG, 用EPI INFO 6.0软件进行统计分析.结果 480名研究对象中TTV DNA的总检出率为23.96%.各种肝炎患者的TTV总阳性率为23.94%,肝癌患者的TTV阳性率为20.69%,而健康者的TTV阳性率为24.84%,义务献血员的阳性率为30.00%,均未见明显差别.从临床类型看,急性肝炎、慢性肝炎和重症肝炎的TTV阳性率都在25%左右;从病原类型看,非甲～戊型肝炎的TTV阳性率为26.19%,并未见与相应健康者的25.23%阳性率的差别;除HCV由于感染率太低而无法分析外,HAV、HBV、HEV阳性肝炎患者间TTV的阳性率分别为20.00%、23.14%、21.79%,未见TTV与这些已知肝炎病毒的明显相关.对一个时期内的全部135例住院肝炎患者及153名健康者进行肝炎病原分析,HAV、HBV、HEV在肝炎患者中的阳性率都要明显高于健康人(P=0.0142),而TTV在肝炎患者中的阳性率与健康人没有明显差别(P=0.6021);对病毒的单独致病性进行分析,HAV、HBV、HEV在非重叠感染的肝炎患者中的阳性率都要明显高于健康人(P=0.0037),而TTV在非甲～戊型肝炎患者中的阳性率仍不高于健康人(P=0.5256).结论 闽南地区的临床流行病学研究未见TTV感染与肝炎的明显相关性.
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TT病毒的检测及部分核苷酸序列比较
目的 为阐明TT病毒(TTV)流行病学特征和基因组异质性以及为血清学诊断试剂的研制提供资料.方法 从健康查体者的血清中提取DNA,设计一套引物,采用套式聚合酶链反应(nested-PCR),检测TTV,对其中7例阳性标本进行了克隆测序,并与2株日本株TTV的核苷酸序列作了比较.结果 111例正常人中TTV的感染率为12.6%.7株中国株TTV间的核苷酸同源性为90.6%～95.4%,与日本株TX011(O)的核苷酸同源性93.0%～95.0%,而与日本株TA278同源性则在72.9%～74.7%之间.所推测的7株中国株TTV间氨基酸同源性为81.9%～99.4%,与日本株TX011(O)氨基酸同源性为85.5%～88.6%,而与日本株TA278氨基酸的同源性仅为68.1%～71.7%.结论 正常人群中TTV的携带率比较高.7株中国株TTV变异相对较小,同源性比较高,与日本株TX011(O)属于同一基因型.氨基酸的变异大于核苷酸变异.
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献血者TT病毒DNA及其IgG抗体的检测
目的观察献血者输血传播病毒(TTV)的感染情况.方法应用Nested-PCR对388例献血者、168例非肝炎住院患者进行TTV DNA检测,同时用ELISA法检测抗TTV IgG.结果 TTV基因检出率分别为献血组15.46%,对照组24.40%;556例受检血清中TTV DNA总的阳性检出率为18.17%,抗TTV IgG检出率分别为献血组13.14%,对照组27.98%;献血组与对照组相比TTV DNA及抗TTV IgG均存在显著性差异(P＜0.05).结论献血者存在TTV感染,TTV存在健康携带状态.
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输血感染TT病毒的检测及致病性的研究
目的探讨受血者接受TTV-DVA阳性血后引起感染的情况.方法采用套式PCR和PCR产物测序,对献血者和受血者进行TTV感染率的调查和基因序列分析.结果 223份献血者血清检出TTV感染9 6份(43.1%),22名受血者输注TTV-DNA阳性血后,有14名(63.6%)转为阳性,其中两名与供血者TTV-DNA序列同源性达100%.仅1例血清转氨酶轻度升高.结论本组献血者中TTV感染率较高,TTV可经血传播感染,但其致病性较弱,4周后,少数受血者TTV-DNA可转为阴性.
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肝炎患者TT病毒感染的研究
关于TT病毒(TTV)的致病性及是否属嗜肝病毒目前仍有争论,为了解肝炎患者中TTV感染情况及有TTV感染患者的临床特点,我们从1998年10月～1999年10月对北京地坛医院肝炎科收治的547例各型病毒性肝炎患者,留取血清标本进行TTV-DNA检测,从中发现120例血清TTV-DNA阳性者,并对其临床特征进行分析.
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TT病毒在恒河猴实验感染的组织嗜性
目的了解TT病毒的嗜肝性.方法 5只实验感染病毒的恒河猴血症期间,采集各种组织,抽提各组织DNA, 分别用病毒双链探针或单链负义探针, 与吸附在纤维膜上的组织DNA进行斑点杂交.结果双链探针与肝、骨髓、脾、胃、小肠和大肠杂交阳性, 表明各该组织中都有无包膜DNA病毒的存在.单链负义探针与各该组织DNA杂交, 仅肝、骨髓和小肠为阳性, 表示存在可能作为病毒复制中间体的正义单链DNA.结论肝、骨髓和小肠可能是病毒的复制场所, 故TT病毒可能具嗜肝性.
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某部连续两年肝炎暴发流行的调查
目的查明某部连续两年发生以单项血清谷丙转氨酶(ALT)升高为特征的肝损害病因,传播途径和临床特点等,彻底控制疫情.方法用流行病学调查方法对某部进行调查,检查全体指战员肝功能及各种病毒标志物,对所有ALT升高者进行个案调查,对部分病人进行肝穿活检、肝组织免疫组化和TTVDNA原位杂交实验.结果115名指战员ALT升高88人(占76.52%).其中TTVDNA阳性占88.64%,HBV-M阳性占3.41%,病原学未明占7.95%;ALT升高者中干部占2.27%,战士占97.73%.机关干部、战士发病率很低,3名职工ALT均正常,发病有明显用餐的聚集性.9例患者肝组织免疫组化实验甲、乙、丙、戊型肝炎病毒标志物均阴性,TTVDNA原位杂交8例阳性.结论初步认为该部暴发型肝炎是一种肠道传播性肝炎,病原是TTV,传播途径是饮食密切接触.
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肝病患者中TT病毒的检测
目的:在153例肝病患者中分析新型肝炎病毒TTV的感染状况.方法:通过设计特异引物采用半巢式PCR反应进行血清标本的TTV DNA检测.结果:在153例肝病患者中,第1轮PCR未见明显的扩增带,在第2轮PCR中33例具扩增带,阳性率为21.6%.其中31例慢性肝炎中6例呈阳性,24例肝硬化中2例阳性,6例肝癌和4例急性肝炎中各1例呈阳性,88例不明原因的肝功能异常者中23例呈阳性.而8例肝功能正常者无1例呈阳性.结论:通过检测在肝病患得中存在TTV感染,这可能是另一种新型的肝炎病原.
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保定市在校大学生TTV重叠感染状况调查
目的 了解保定市高校大学生中不同人群TT病毒的感染状况.方法 采用半巢式聚合酶链反应(semi- nested PCR)对健康人群、肝炎患者及HCV感染者等5组人群血清进行TTV DNA检测.结果 保定市高校大学生中不同人群血清TTVDNA总阳性率17.6％,健康人群血清TTV DNA阳性率9.3％.其他人群血清TTV DNA阳性率由高到低依次为丙型肝炎组31.6％、乙型肝炎组26.9％、急性甲型肝炎组16.7％、HCV感染组9.3％.急性甲型肝炎组、HCV感染组血清TTV DNA阳性率与健康人群比较差异无统计学意义(P＞0.05)；丙型肝炎组、乙型肝炎组血清TTV DNA阳性率与健康人群比较差异有统计学意义(P＜ 0.01).结论 大学生中广泛存在TTV感染组,丙型肝炎、乙型肝炎患者的感染率较高.
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上海部分健康体检人员中感染TTV的基因分型
目的调查上海地区健康人群TTV感染情况及其基因分型.方法用PCR法检测血清标本中的TTV DNA,对TTV DNA阳性标本作核酸序列测定.结果 100份健康体检人员血清标本,用PCR法检出TTV DNA阳性标本21份.其中14份作了部分序列测定,10份部分序列与TTV G1a基因亚型组的TA278株等的同源性为96.2%～99.5%.另4份与G1a组同源性为66.2%～67.6%,与TTV G4基因型组同源性为81.9%～84.8%,与国内报道的各株TTV中同源性大的61.SEQ为81.9%～84.3%.结论上海地区部分健康人群中除分布有TTV G1a基因亚型感染外,还分布有国内未见报道的TTV基因型感染,其可归为TTV G4的一基因亚型.
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不同人群TTV检测及阳性标本核苷酸序列分析
目的了解不同人群TTV感染状况及基因型别,探讨TTV传播途径.方法设计合成引物采用半套式聚合酶链反应方法,对献血者、肝炎病人、幼儿及母婴配对等4组人群血清进行TTV DNA的PCR检测并对部分阳性株进行序列测定及分析.结果 (1)在457份被检血清中检测出TTV DNA阳性111份,总阳性率24.29%.在血清转氨酶(ALT)正常的96份献血者血清标本中TTV DNA阳性检出率为16.6%,而在ALT异常、HBsAg及抗HCV阴性的99份献血者血清标本中,TTV DNA的阳性检出率为36.3%,明显高于ALT正常献血者.(2)在72例不同肝炎病人血清中,TTV DNA阳性检出率为54.16%;在非甲-庚型肝炎病人中TTV DNA阳性率为87.5%,高于甲-庚型肝炎的病人中TTV DNA阳性率.(3)110份体检幼儿血清中,共检出TTVDNA阳性14份,总检出率为12.73%.(4)一对母婴配对血清的TTV DNA同时阳性且序列相同.(5)12个阳性株序列分析结果显示:11株分属于G1、G22个基因型的5个亚型,而另1株与Gla、Glb的同源性为74.8%～80.2%.结论 (1)献血者人群中存在TTV感染,TTV可以导致感染个体的肝功能异常.(2)TTV感染与肝炎有关,可能是非甲-庚型肝炎的病原之一.(3)TTV可能存在血源途径外的其它传播选径;TTV存在母婴垂直传播途径.
