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TIEGsiRNA对AGEs介导肾小管上皮细胞PAI-1表达的影响
目的 观察TIEG基因沉默对AGEs介导肾小管上皮细胞PAI-1表达的影响.方法 以pshRNA-copGFP-lentivector作为载体,构建含有TIEG基因的慢病毒载体psiRNA-TIEG,转染至正常大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E),然后给予AGEs刺激24 h和48 h,采用Western blot方法 测定PAI-1蛋白的表达水平.结果 AGEs以时间依赖方式上调NRK52E细胞TIEG mRNA和PAI-1蛋白表达.TGF-β1中和抗体可有效降低AGEs刺激NRK52E细胞48 h后PAI-1的表达水平(1.150±0.089 vs 0.707±0.015,P<0.05).TIEGsiRNA转染后可显著下调AGEs刺激NRK52E细胞48 h后TIEG mRNA表达水平(0.852±0.019vs0.448±0.028,P<0.01),及PAM蛋白表达水平(0.396±0.042vs 0.245±0.063,P<0.05).结论 TIEG基因沉默能有效抑制AGEs诱导NRK52E细胞PAI-1的表达.
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载体介导的siRNA抑制TIEG在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达
目的 构建siRNA稳定表达载体,抑制TIEG基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达,为研究TIEG在瘢痕疙瘩等纤维化疾病发生中的作用提供有效的实验工具.方法 根据siRNA设计原则设计并合成带有双向启动子具有转录功能的siRNA载体,转入成纤维细胞内,干扰TIEG基因的表达,利用载体可以发荧光观察转染效果,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测siRNA对TIEG基因的抑制效果.结果 瘢痕成纤维细胞经RNAi沉默后TIEGmRNA表达下调.结论 成功建立siRNA载体,并在瘢痕疙瘩成纤维细胞中抑制TIEG基因的表达.
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TIEG特异siRNA对糖基化终末产物介导的肾小管上皮细胞Smad2表达的影响
目的 以RNA干扰技术沉默TGF-β诱导早期基因(TIEG)的表达,观察TIEG沉默对糖基化终末产物(AGEs)介导的肾小管上皮细胞Smad2表达的影响.方法 以pshRNA-copGFP-lentivector作为载体,构建含TIEG特异siRNA的慢病毒载体psiRNA-TIEG,将其转染至大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E),然后给予糖基化修饰的牛血清白蛋白(AGE-BSA)刺激24 h和48 h,采用PCR方法测定其TIEG mRNA、Smad2 mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法测定Smad2蛋白表达水平.以转染空质粒载体组作为对照.结果 TIEG特异的siRNA可有效下调AGEs诱导的TIEG mRNA、Smad2 mRNA和蛋白表达,与空质粒载体组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 TIEG的沉默能有效抑制AGEs介导的NRK52E细胞Smad2 mRNA和蛋白的表达.
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TIEG特异的siRNA慢病毒载体的构建及鉴定
目的 构建TIEG基因siRNA慢病毒载体.方法 针对已经筛选确定的TIEG基因siRNA有效靶序列.合成靶序列的Oligo DNA退火形成双链DNA与经BamH Ⅰ和EcoRl酶切后的PshRNA-copGFP-lendvector慢病毒载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生psiRNA-TIEG慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆.测序鉴定,用psiRNA-TIEG和病毒包装系统共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度;用包装病毒颗粒注射大鼠,通过RealTime-PCK检测大鼠肾组织TIEG mRNA的表达水平.结果 PCR和测序证实,成功构建TIEG siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1×10<'5>ifu/μL;实验组大鼠TIEGmRNA的表达水平明显低于对照组(50.7%).结论 成功构建大鼠TIEG基因siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG.
