首页 > 文献资料
-
RNAi干扰Notch-1对人肝癌细胞BEL-7402AFP表达及细胞增殖的影响
目的 采用RNAi干扰细胞通讯因子Notch-1对肝癌细胞BEL-7402中AFP表达及细胞增殖的影响.方法 通过siRNA抑制BEL-7402细胞中Notch-1的表达,采用qRT-PCR和Western blotting法,检测其对AFP表达的影响,采用MTI法测定细胞增殖情况.结果 siRNA抑制Notch-1达后,AFP mRNA及其蛋白水平显著下降,RNAi干扰组与对照组比较BEL-7402细胞生长明显受抑制(P＜0.01).结论 Notch-1 siRNA可以下调肝癌细胞BEL-7402中AFP mRNA及其蛋白的表达水平,抑制BEL-7402细胞的生长,提示Notch-1基因在肝癌细胞的发生、发展中具有重要作用,Notch-1可能是AFP过量表达肝癌的治疗靶点.
-
MicroRNA-4279通过靶向核心启动子区域上调Notch-1基因表达进而抑制细胞凋亡
[目的]寻找与Notch-1基因核心启动子结合的microRNA (miRNA)并阐明其调控功能,研究免疫细胞肿瘤的发生发展机制.[方法]首先使用生物信息学手段筛选与Notch-1基因核心启动子区域结合的miRNA,进而利用荧光素酶报告系统对其调控作用进行实验验证;通过突变核心启动子上的结合位点进一步确定该miRNA特异性靶向基因核心启动子区域.检测转染该miRNA后H9细胞中Notch-1的mRNA与内源蛋白表达水平.另外通过转染该miRNA并用H2O2诱导凋亡,研究该miRNA对H9细胞凋亡的影响.进一步在上述实验条件下,使用siRNA降低靶基因(Notc h-1)的表达,然后检测miRNA对H9细胞系的凋亡的影响.[结果]首先通过软件预测,我们发现了miR-4279可以与Notch-1的核心启动子序列结合.荧光素酶报告实验表明miR-4279可以增强Notch-1启动子的转录活性;而在miR-4279的靶位点引入突变后,该增强作用消失.RT-qPCR和Western Blot实验表明miR-4279能够显著增强内源Notch-1 mRNA与蛋白的表达.H2O2诱导凋亡实验表明,miR-4279可以抑制H9细胞的凋亡.siRNA干扰实验表明,当Notch-1通路被抑制后,miR-4279导致的细胞凋亡抑制的效果消失.[结论]miR-4279通过靶向Notch-1基因核心启动子区域,特异性增加Notch-1基因的表达,进而增强H9细胞对H202诱导的凋亡的抗性.
-
Notch-1在骨髓间质干细胞分化为神经细胞中的作用
目的:采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,抑制Notch-1基因的表达,从而观察Notch-1基因在骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经细胞后的存活及分化中的作用.方法:构建mNotch-l短发夹状RNA(short hairpin RNA,mNotch-1shRNA);然后对mNotch-lshRNA转染的MSCs进行形态学观察;MTT检测转染前、转染24h、转染3天的MSCs的存活率;体外条件下采用BDNF、全反式维甲酸等诱导mNotch-lshRNA转染的MSCs分化,采用免疫细胞化学染色,检测Nestin、NSE及NF200(神经元标记物)、GFAP(神经胶质细胞标记物)的表达.结果:mNotch-lshRNA转染成功的细胞立体感增强,Notch-1基因表达消失,转染后24h和3天的MSCs细胞存活率下降,与未转染和转染对照组比较有显著性差异(P＜0.01);转染mNotch-1shRNA的MSCs向神经细胞的分化效率显著提高,NSE、NF200的表达均高于未转染的和转染对照组的,且未见GFAP表达.结论:mNotch-lshRNA抑制Notch-1基因的表达,促进MSCs向神经细胞的分化效率,提示MSCs的横向分化过程可能与神经干细胞类似,阻断Notch信号通路,会加MSCs向神经细胞分化的效果.
-
人Notch-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定
目的：构建及鉴定人Notch-1基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒载体，寻找佳RNAi慢病毒载体。方法针对人Notch-1基因序列，按照RNAi序列设计原则，设计3段RNAi靶点序列（shRNA1~3），通过限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、T4DNA连接酶连接，将Notch-1基因序列插入慢病毒载体pLenOR-THM，构建pLenOR-THM-Notch-1重组载体。质粒转化感受态DH5α细菌，筛选阳性克隆，经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染293T细胞，进行慢病毒包装并测定病毒滴度，观察感染效率。各组病毒载体转染ACC-M细胞后，运用定量逆转录聚合酶链反应和Westernblot检测Notch-1基因mRNA和蛋白的表达水平。结果成功构建慢病毒载体pLenOR-THM-Notch-1，四质粒共转染293T细胞后可见大量绿色荧光；浓缩后的病毒滴度为5.8×108TU·mL-1；以复感染系数为1时感染293T细胞，感染效率在90％以上。QRT-PCR和Westernblot检测结果表明，pLenOR-Notch-1-shRNA3组受抑制程度高。结论成功构建了人Notch-1RNAi慢病毒载体。
-
Notch－1与p53、Ki－67在不同生物学行为胃癌中的表达
目的：探讨不同生物学特性胃癌中Notch－1基因与p53蛋白、Ki－67表达的意义。方法采用免疫组织化学染色方法检测胃癌及其癌旁组织中的Notch－1、p53、Ki－67的表达，进行相关性分析。结果 Notch－1、p53、Ki－67在胃癌组织中的阳性表达率分别为57．5％（48／80）、47．5％（38／80）、52．5％（42／80），均明显高于癌旁组（分别为28．1％、0％、和12．5％，P＜0．05），并且都与肿瘤分化程度、脉管浸润明显呈正相关（P＜0．05）；p53、Ki－67与淋巴结转移明显相关（P＜0．05），但Notch－1与肿瘤浸润深度、淋巴结转移无明显相关性（P＞0．05）；Notch－1与p53、Ki－67表达均有高度正相关性。结论 Notch－l与p53在胃癌的进展中可能共同起作用，联合检测Notch－1、p53、Ki－67可能成为胃癌患者预后判断重要参考指标。
