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视网膜神经节细胞凋亡的信号通路研究进展
视网膜神经节细胞(RGCs)的进行性凋亡是许多视网膜病变和视神经疾病进展到后的必经之路,是多种眼病致盲的根本原因.RGCs对外界因素的影响异常敏感,外伤、高眼压、炎症和神经毒素等均可造成其不可逆的损伤,而这些细胞外信号又通过不同的途径影响着细胞内部的信号转导,调节细胞内凋亡相关基因的表达,终造成RGCs的凋亡.本文从细胞外部因素的诱导、细胞内部的信号传递和基因调控3个方面总结病理情况下RGCs凋亡信号转导通路研究的新进展,旨在为视网膜神经保护药物的开发提供新的思路.
关键词： 视网膜神经节细胞/病理学 细胞凋亡/诱导因素 基因 信号转导通路 神经保护/药物 -
阿克苷对大鼠视网膜神经节细胞保护作用及其安全性研究
目的 观察大鼠玻璃体腔注射阿克苷的安全性及其对视网膜神经节细胞(RGC)保护作用.方法 190～210 g清洁级健康雌性Sprague Dawley大鼠50只纳入研究.其中,15只大鼠用于阿克苷玻璃体腔注射安全性研究.随机分为实验1、2、3组、对照组和空白对照组,每组3只大鼠.其中,实验1、2、3组分别玻璃体腔注射1、2、5 mg/ml的阿克苷溶液5μl;对照组玻璃体腔注射磷酸盐缓冲溶液(PBS)5 μl;空白对照组不施加任何干预.1、2、3周后摘除眼球行冷冻切片,苏木精-伊红(HE)染色光学显微镜观察视网膜结构,1、3周行超薄切片透射电子显微镜观察视网膜超微结构.其余大鼠用于阿克苷对RGC保护作用研究.随机分为手术A、B组,假手术C、D组和空白对照组.其中,手术组及假手术组各组均为8只大鼠,空白对照组3只大鼠,共35只.手术组大鼠在暴露视神经后夹持视神经10s,假手术组大鼠仅暴露视神经.手术A、B组分别经玻璃体腔注射1 mg/ml阿克苷5μl、PBS液5μl;假手术C、D组分别经玻璃体腔注射1 mg/ml阿克苷5 μl、PBS液5μl;空白对照组不施加任何干预.1、2、4周后摘除眼球行冷冻切片,部分切片HE染色后光学显微镜观察视网膜结构,计数RGC;部分切片行免疫组织化学二步法检测生长相关蛋白43(GAP 43)表达,原位切口末端标记(TUNEL)法检测RGC凋亡情况,计数RGC及阳性细胞数,计算细胞凋亡率.采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析.结果 阿克苷玻璃体腔安全性评价研究中,玻璃体腔注射后,大鼠角膜、前房、晶状体、玻璃体腔及视网膜均未见异常.光学显微镜观察显示,第1、2、3周时视网膜各层结构排列整齐,未见明显细胞凋亡、坏死特征及炎性细胞浸润;RGC轻度水肿.透射电子显微镜观察显示,5、2 mg/ml阿克苷玻璃体腔注射后大鼠视网膜微结构发生明显改变,1 mg/ml阿克苷注射后大鼠视网膜微结构轻微变化.阿克苷对RGC保护作用研究中,光学显微镜观察显示,手术组大鼠视网膜可见典型细胞凋亡表现,假手术组和空白对照组大鼠视网膜均未见明显改变.玻璃体腔注射后1周,手术组RGC数较假手术组和空白对照组少,第2周继续减少,手术A组RGC数多于手术B组,差异有统计学意义(F=26.206,P＜0.05).第4周手术组RGC继续减少,与第1、2周时手术组RGC数比较,差异有统计学意义(F=17.364,P＜0.05),各时间点假手术组间和假手术组与空白对照组间RGC数比较,差异无统计学意义.GAP-43检测结果显示,玻璃体腔注射后1周,手术组大鼠视网膜积分吸光度(IA)值明显高于其他组,差异有统计学意义(F=33.466,P＜0.05);手术A、B组间IA值比较,差异无统计学意义.玻璃体腔注射后2周,手术组大鼠视网膜IA值略下降,且高于其他组;手术A组IA值高于手术B组,差异有统计学意义(F=14.391,P＜0.05).玻璃体腔注射后4周,手术组大鼠视网膜IA值进一步下降;手术A组与其他组IA值比较,差异有统计学意义(F=4.178,P＜0.05).TUNEL检测结果显示,玻璃体腔注射后1周,手术组大鼠RGC凋亡明显增加,与其他组比较,细胞凋亡率差异有统计学意义(F=15.365,P＜0.05).玻璃体腔注射后2周,手术组RGC凋亡率均降低,手术A组大鼠细胞凋亡率低于手术B组,差异有统计学意义(F=12.767,P＜0.05).玻璃体腔注射后4周,手术组大鼠细胞凋亡率明显下降,与其他组比较,差异无统计学意义(F=2.057,P＞0.05).假手术组和空白对照组细胞凋亡率在各时间点、各组间比较,差异无统计学意义.结论 阿克苷玻璃体腔注射具有可行性;1 mg/ml阿克苷对大鼠视网膜影响小,为其安全剂量.玻璃体腔注射阿克苷可增加GAP-43表达,对视神经钳夹伤大鼠RGC凋亡具有一定抑制作用.
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α-硫辛酸对高压条件下培养大鼠视网膜神经节细胞的保护作用
目的 观察α-硫辛酸对高压条件下培养大鼠视网膜神经节细胞(RGC)的保护作用.方法 将RGC分为正常对照组、阴性对照组、单纯加压组、加压联合不同浓度α-硫辛酸干预组.正常对照组和单纯加压组不做任何处理;阴性对照组仅接受200 μmol/Lα-硫辛酸预处理;加压联合不同浓度的α-硫辛酸干预组分别用50、100、200 μmol/L等3种不同浓度的α-硫辛酸对其进行干预.α-硫辛酸预处理1h后,单纯加压组和各干预组置于50 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)下培养24 h;正常对照组、阴性对照组置于常压下培养24 h.分别用噻唑蓝比色法检测各组细胞的活性;4,6-联脒2-苯基吲哚(DAPI)染色观察各组细胞核形态改变;实时聚合酶链反应(Real-time PCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测并比较各组细胞中锰超氧化物歧化酶(MnSOD) mRNA和蛋白表达水平的变化.结果 单纯加压组细胞活性为(65.6±3.4)％,50、100、200 μmol/L3种浓度的α-硫辛酸干预组细胞活性分别为(75.1±3.3)％、(81.8±2.9)％、(87.9±3.1)％,均较单纯加压组显著增高(t=5.108、10.007、12.513,P＜0.05).DAPI染色显示,加压后RGC-5细胞核可见空泡、染色质高度凝聚、边缘化等典型的凋亡特征,而α-硫辛酸干预组仅有部分细胞核染色质表现出浓缩现象.Real-time PCR及Western blot检测结果显示,加压培养后细胞内MnSODmRNA和蛋白相对表达量较正常对照组显著降低(t=22.045、26.979,P＜0.01);与单纯加压组相比,α-硫辛酸干预组细胞内MnSOD mRNA和蛋白相对表达量均显著增高,差异有统计学意义(t=9.171、12.267、23.567、7.723、12.009、28.198,P＜0.05);不同浓度的α-硫辛酸干预组之间,随α-硫辛酸浓度增加,MnSODmRNA和蛋白相对表达量呈升高趋势,且差异有统计学意义(F=134.273、194.597,P＜0.01).结论 应用α-硫辛酸可以显著提高高压条件下大鼠RGC的细胞活性及细胞内MnSOD的表达水平,增强细胞抗氧化损伤能力.
关键词： 视网膜神经节细胞/病理学 硫辛酸/治疗应用 细胞 培养的 动物实验 -
腺苷抑制P2X7和N-甲基-D-天冬氨酸受体诱导的视网膜神经节细胞死亡
目的 研究腺苷(adenosine)对嘌呤受体P2X7和谷氨酸N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)受体激活诱导的大鼠视网膜神经节细胞(RGC)死亡的神经保护作用.方法 (1)对新生Long-Evan大鼠进行上丘注射荧光标记物荧光金(aminostilbamidine)以标记RGC,检测P2X7激动剂BzATP(50μmol/L)、谷氨酸NMDA受体激动剂(100 μmol/L)和腺苷(300 μmol/L)对体外培养RGC存活率的影响;(2)体外培养未经荧光金标记的新生大鼠RGC,以10 μmol/L钙离子(Ca2+)荧光染料Fura 2乙酸甲酯(Fura-2 Am)标记后,利用Ca2+影像测定仪分别测定BzATP、NMDA和腺苷对RGC内Ca2+浓度的影响.结果 BzATP和NMDA均可引起体外培养的RGC死亡,BzATP在50μmol/L、NMDA在100μmol/L浓度下,均杀死约30%RGC.而300μmol/L腺苷则可明显减轻两者对RGC的毒性作用,使RGC存活率分别从68.9%±2.3%、69.9%±3.2%提高至91.2%±3.5%(P＜0.001)、102.1%±3.9%(P＜0.001).BzATP可引起RGC内Ca2+持续升高,在50 μmol/L浓度下可使细胞内Ca2+升高至(1183±109)nmol/L.在300μm0l/L腺苷作用下,BzATP介导的Ca2+升高幅度显著降低,仅升高为(314±64)nmol/L(P＜0.001).结论 腺苷能阻止P2X7受体和NMDA受体激活诱导的RGC死亡和细胞内钙离子浓度升高,具有神经保护作用.
关键词： 腺苷/治疗应用 受体.嘌呤能 受体 谷氨酸 视网膜神经节细胞/病理学 -
移植含嗅鞘细胞和体外溃变的周围神经对成年大鼠视网膜神经节细胞轴突再生作用的比较
目的 比较含嗅鞘细胞(OEC)或(和)体外溃变的周围神经移植对成年大鼠视网膜神经节细胞(RGC)轴突再生的影响.方法 将24只成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为4组,每组各6只大鼠:A组(周围神经对照组):将取出的一段自体坐骨神经与眶内切断的左侧视神经近侧断端吻合;B组(OEC注入周围神经组):自取出的坐骨神经两端注入10 μl OEC悬液后移植于视神经断端.C组(周围神经体外溃变组):将取出的坐骨神经在体外单独培养5 d后植于视神经断端;D组(OEC-周围神经共培养组):将取出的坐骨神经与OEC共培养5 d后植于视神经断端.移植术后4周处死动物,计数各组以5%荧光金逆行标记的再生RGC数量. 结果 B、C、D三组RGC均数1481±268、1235±266和1464±285显著高于A组799±109(P值分别为0.0002、0.0010和0.0003);B、C、D三组间差异无统计学意义(P值分别为0.3644、0.9167和0.4344). 结论 OEC具有促进RGC轴突在新鲜周围神经移植物中再生的作用,但这种作用与体外溃变的周围神经相比无明显差异,二者亦无协同作用.
关键词： 视网膜神经节细胞/病理学 细胞移植 -
高功率微波对视网膜神经节细胞脂质过氧化作用的实验研究
目的 观察微波对体外培养的兔视网膜神经节细胞的脂质过氧化损伤作用.方法 体外培养兔神经节细胞,以平均功率为80 mW/cm2的微波进行辐照,辐照时间分别为15、30、45 min.辐照后立即于倒置显微镜和电镜下观察细胞形态变化,羟胺法和改良硫代巴比妥酸荧光法分别测定细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量.结果 微波辐照后,细胞轴突消失,电镜可见线粒体及内质网肿胀.随辐照时间延长,细胞逐渐趋向于坏死,细胞MDA含量增高,45 min辐照组MDA含量为对照组的5.11倍.SOD则逐渐降低.结论 微波可引起视网膜神经节细胞脂质过氧化损伤,脂质过氧化反应可能是微波视网膜损伤的作用机制之一.
关键词： 微波/副作用 视网膜神经节细胞/病理学 脂质过氧化作用 -
视野前青光眼视盘及黄斑神经节细胞复合体相关参数测量分析
目的 观察视野前青光眼(PPG)患者视盘参数和黄斑神经节细胞复合体(GCC)结构的变化.方法 检查确诊的PPG患者18例18只眼(PPG组)、原发性开角型青光眼(POAG)患者22例22只眼(POAG组)、生理性大视杯者20例20只眼(生理性大杯组)纳入研究.随机选取同期健康自愿者为正常组.采用傅里叶域光相干断层扫描对所有受检者的视盘和黄斑区进行扫描,测量视盘平均、上方、下方、颞上、颞下、鼻上、鼻下、颞侧偏上、颞侧偏下、鼻侧偏上、鼻侧偏下象限的神经纤维层厚度(RNFL),视盘盘沿容积(RV)、视盘容积(NHV)、视盘面积(ODA)、盘沿面积(RA)、视杯容积(CV)、杯盘面积比(CDAR)、垂直杯盘比(VCDR)、水平杯盘比(HCDR)及视杯面积(CA)等参数以及黄斑GCC、上方GCC、下方CGG厚度和局部丢失体积(FLV)、整体丢失体积(GLV)值.比较各组间上述参数的差异.结果 PPG组较正常组颞上、颞下、颞侧偏上、颞侧偏下、上方、下方及平均RNFL厚度减少,差异有统计学意义(P＜0.05).PPG组鼻侧偏上的RNFL厚度较POAG组RNFL厚度增加,差异有统计学意义(P＜0.05).PPG组患眼RNFL厚度与POAG组相比,颞上、颞下、颞侧偏上、上方、下方、平均RNFL厚度减少,差异有统计学意义(P＜0.05).PPG组RV、NHV、ODA、RA较正常对照组均减少,差异有统计学意义(P＜0.05);CV、CDAR、VCDR、HCDR、CA较正常对照组均增大,差异有统计学意义(P＜0.05).PPG组各视盘参数与POAG组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).PPG组与生理性大视杯组比较,RV、NHV、ODA、RA均减少,CV、CDAR、HCDR、VCDR及CA均增加.CDAR、VCDR、RA差异有统计学意义(P＜0.05).PPG组与正常组比较,平均黄斑GCC、下方GCC、上方GCC厚度均降低,GLV、FLV值均增大,差异均有统计学意义(P＜0.05).PPG与平均黄斑GCC、下方GCC、上方GCC厚度与POAG组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).PPG组与生理性大视杯组比较,黄斑平均GCC、上方GCC、下方GCC均变薄,GLV、FLV值均增大,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 PPG患者RA、NHA、ODA、RV、黄斑GCC值较正常人、生理性大视杯者减小;与POAG者无明显差异.
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雄激素预处理对实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠视神经和视网膜神经节细胞的影响
目的 观察雄激素预处理对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)大鼠视神经形态功能和视网膜神经节细胞(RGC)凋亡的影响. 方法 将雌性Wistar大鼠41只随机分为正常组10只、未用药对照组15只和雄激素组16只.正常组和未用药对照组每天以1%乙醇灌胃,雄激素组每天以0.25 mg/kg甲睾酮灌胃.用药20 d后,未用药对照组和雄激素组注射0.4 ml完全弗佐剂-豚鼠脊髓匀浆,并辅以注射百日咳疫苗诱导EAE模型.诱导前7 d,大鼠上丘和外侧膝状体注射荧光金以逆行标记RGC.继续用药至诱导后14～30 d,取正常鼠和出现症状48～72 h内的未用药对照组和雄激素组大鼠,应用光学显微镜和闪光视觉诱发电位(FVEP)观察其视神经形态和功能的变化;荧光显微镜下观察视网膜铺片并计数RGC;原位缺口末端标记法(TUNEL)观察RGC的凋亡情况. 结果 诱导后10 d开始,EAE大鼠相继出现尾及后肢无力,麻痹等症状.与未用药对照组相比.雄激素组的发病潜伏期延长(P=0.035),症状评分降低(P=0.042).未用药对照组大鼠视神经纤维走行纡曲呈波浪状,弥漫脱髓鞘改变;雄激素组视神经纤维走行较规则,脱髓鞘改变不明显.FVEP显示与未用药对照组相比,雄激素组的N1,P和N2波潜伏期明显缩短(P<0.05),N1-P和P-N2振幅提高(P<0.05).正常组、未用药对照组和雄激素组RGC数分别为(2284±132)、(934±78)、(1725±95)个/mm2,雄激素组RGC数较未用药对照组增多(P=0.028).正常组、未用药对照组和雄激素组TUNEL阳性细胞数分别为(4.02±0.16)、(24.44±2.22)、(9.84±2.36)个/高倍视野,雄激素组TUNEL阳性细胞数较未用药对照组明显减少(P=0.025). 结论雄激素可降低EAE发病率和症状评分,抑制EAE鼠RGC的凋亡,减轻视神经脱髓鞘改变,改善视神经传导功能.
