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MK886对人结肠癌细胞 HT-29增殖及 Ascl2表达的影响
目的：探讨5-脂氧合酶活化蛋白（ FLAP）抑制剂MK886对人结肠癌细胞HT-29增殖的影响及其作用机制。方法分别采用12．5、25、50、75、100、200μmol／L的MK886干预体外培养的HT-29细胞，分别于干预24、48 h时采用CCK-8法测定细胞增殖抑制率，结果显示MK886抑制HT-29细胞增殖佳作用时间为48 h、佳浓度为48．12μmol／L。选择48．12μmol／L MK886干预HT-29细胞（MK886组），另设对照组（不干预），干预24 h时采用Real-time PCR技术检测Ascl2 mRNA表达，干预24、48、72 h时分别采用Western blotting 法检测 Ascl2 mRNA和蛋白表达。结果经过48．12μmol／L MK886干预24 h时HT-29细胞中Ascl2 mRNA相对表达量为0．35±0．02，对照组为0．72±0．02，两组比较P＜0．01。48．12μmol／L MK886作用24、48、72 h时HT-29细胞中Ascl2蛋白相对表达量分别为1．75±0．13、1．10±0．15、0．71±0．19，均较对照组降低（ P均＜0．05）；且随着MK886作用时间延长， Ascl2蛋白相对表达量逐渐下调（P均＜0．05）。结论 FLAP抑制剂MK886能抑制人结肠癌细胞HT-29增殖，其机制可能与下调Ascl2 mRNA和蛋白表达有关。
关键词： 结肠癌 MK886 5-脂氧合酶活化蛋白 Ascl2 -
miRNA-302b在结肠癌HT-29细胞“干性”维持中的作用
目的 探讨miRNA-302b在结肠癌HT-29细胞“干性”维持中的作用及可能机制.方法 体外培养人结肠癌细胞株HT-29,转染miRNA-302b模拟物(miRNA-302b mimics),同时以未转染组(control)和阴性模拟物转染组(negative control-mimics,NC-mimics)作为对照,采用实时定量反转录聚合酶链反应法(real-time PCR)检测HT-29细胞结肠癌“干性”标志物Ascl2、Lgr5、Oct4和Sox2mRNA的表达情况;采用蛋白印迹法(Western blot)检测以上“干性”标志蛋白表达的变化;采用克隆形成实验及干细胞成球实验分别观察HT-29细胞克隆形成和细胞球形成能力的变化.结果 Realtime PCR结果示,miR-302b mimics转染HT-29细胞48 h,“干性”标志物Ascl2、Lgr5、Oct4和Sox2rmRNA表达一致性上调(P＜0.05);Western blot结果示Ascl2、Lgr5、Oct4和Sox2蛋白表达也上调(P＜0.05).克隆形成实验及干细胞成球实验结果示,miR-302b mimics转染后HT-29细胞克隆形成和细胞球形成能力增强,与control组和NC-mimics组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 miRNA-302b可通过上调“干性”标志物Ascl2、Lgr5、Oct4和Sox2的表达促进HT-29细胞的克隆形成和细胞球形成能力,从而在结肠癌“干性”维持中发挥重要作用.
关键词： 结肠癌 微小RNA-302b 干性 Ascl2 LGR5 -
Ascl2和microRNA-200家族在结肠癌组织和癌旁组织中的定量表达及二者的相关性分析
目的 探讨Ascl2与MicroRNA-200家族在结肠癌(colorectal cancer,CRC)组织及癌旁组织中的表达及二者的相关性.方法 采用实时定量PCR检测50例结肠癌患者的结直肠癌组织及其癌旁组织中Ascl2与MicroRNA-200家族表达,用SPSS 18.0统计软件进行统计分析.结果 Ascl2在癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P＜0.01),除了MicroRNA-429在癌组织中的表达与癌旁组织相比无统计学差异(P =0.2139),MicroRNA-200家族成员在癌组织中的表达都显著低于癌旁组织(P＜0.05);且Ascl2和MicroRNA-200家族成员在癌组织中表达都呈负相关(r＜-0.5,P＜0.05).结论 发现与正常结直肠黏膜组织相比,Ascl2在结直肠癌组织中表达增高,MicroRNA-200家族表达降低,它们在结直肠癌组织中的表达呈现负相关.
关键词： 结肠癌 Ascl2 MicroRNA-200家族 -
Ascl2转录调控人结肠癌上皮细胞内CDX2基因表达的研究
目的 探讨Ascl2对人结肠癌上皮细胞中CDX2基因的转录调控作用.方法 预测CDX2启动子的转录因子结合位点,构建包含8个不同长度的CDX2近端启动子的荧光素酶报告基因质粒,分别命名为pGL3-CDX2-C 1-8;将各质粒分别转染到shRNA-Ascl2/LS174T和shRNA-Ctr/LS174T细胞中,检测细胞中的双荧光素酶活性.采用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术,用Ascl2抗体免疫沉淀与CDX2启动子区DNA片段相结合的Ascl2,PCR扩增CDX2启动子的特异性序列.结果 转录因子数据库预测到CDX2近端启动子区含多个E-box结合位点和潜在的Nkx-2、GATA-1、CdxA、Sox-5、SRY等顺式作用元件.双酶切及测序结果证实pGL3-CDX2-C1-8重组质粒插入片段序列均正确.重组质粒在shRNA-Ascl2/LS174T细胞中的荧光素酶活性明显高于shRNA-Ctr/LS174T细胞(P＜0.01).随着CDX2启动子片段的缩短,荧光素酶活性呈升高趋势.ChIP实验证实在CDX2近端启动子存在与Ascl2相结合的片段,在shRNA-Ascl2/LS174T细胞中,Ascl2与CDX2启动子区域中-841 ～-646、-291 ～-134、-7～+138片段结合的DNA片段明显少于对照shRNA-Ctr/LS174T细胞.结论 Ascl2在结肠癌上皮细胞中可能通过与CDX2近端启动子的直接结合而达到转录阻遏CDX2基因表达的目的.
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干扰结肠癌上皮细胞Ascl2的表达致其向杯状细胞表型分化
目的 探讨转录因子Ascl2对结肠癌细胞分化的影响.方法 采用Ascl2分子干扰质粒和对照质粒对结肠癌HT -29和LS 174T细胞进行转染,通过G418筛选建立稳定转染的细胞系,采用RT-PCR和Western blot方法检测干扰Asel2分子表达对肠杯状细胞标志物Muc2和TFF3表达的影响.结果 成功构建了shRNA-Ascl2/EGFP质粒以及对照质粒shRNA-control/EGFP,经测序与预期相符,G418筛选获得shRNA-Ascl2/HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-Ascl2/LS174T和shRNA-Ctr/LS174T稳定转染细胞.RT-PCR和Western blot检测证实干扰质粒能够有效地抑制HT-29和LS174T细胞内的Ascl2的表达(P＜0.01).RT-PCR检测发现Muc2和TFF3 mRNA表达水平在Ascl2干扰后的HT-29细胞内均明显上调(P＜0.05)；Muc2 mRNA表达水平在Ascl2干扰后的LS174T细胞内明显上调,差异有统计学意义(P＜0.05),但是TFF3 mRNA表达水平在Ascl2干扰后的LS174T内升高不明显(P＞0.05).Western blot检测发现Muc2蛋白质表达水平在Ascl2干扰后明显上调(P＜0.05).结论 干扰结肠癌HT-29和LS174T细胞内Ascl2的表达导致其向杯状细胞的表型分化.
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活体成像观察Ascl2-RNAi对结肠癌HT-29细胞裸鼠移植瘤生长的影响
目的 小动物活体成像直观观察转录因子Ascl2对结肠癌HT-29细胞裸鼠移植瘤生长的影响.方法 构建Ascl2的shRNA干扰质粒,对人结肠癌HT-29细胞进行瞬时转染48 h,G418筛选、克隆挑取、扩增培养建立稳定转染的细胞系,采用小动物活体成像仪直观观察Ascl2-RNAi对裸鼠移植瘤生长的影响.结果 成功构建Ascl2的shRNA干扰质粒,并进行测序验证;质粒转染HT-29细胞,经G418筛选后挑选稳定转染的克隆,进行扩增培养,成功建立稳定转染的细胞系,命名为shRNA-Ascl2/HT-29和shRNA-control/HT-29细胞,并采用Western-blot证实干扰效果(P＜0.01);采用小动物活体成像仪直观观察发现Ascl2-RNAi抑制HT-29细胞裸鼠移植瘤的生长.结论 Ascl2-RNAi导致结肠癌HT-29细胞体外致瘤能力下降,小动物活体成像技术直观、灵敏度高、实验成本低,值得进一步推广应用.
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Ascl2和结肠癌关系的研究进展
已有资料显示,Ascl2属于保守的转录因子家族中的一员,含有碱性/螺旋-环-螺旋结构,其在正常组织中的表达仅仅被发现在胎盘滋养层细胞及定位在肠道隐窝基底Lgr5(+)的隐窝基底柱细胞.近几年研究发现,Ascl2与结肠癌的发生、发展、转移及预后密切相关,推测其可作为结肠癌临床诊治的新靶标.本文就Ascl2与结肠癌发生发展的相关研究进展进行综述.
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与滤泡辅助性T(Tfh)细胞分化发育相关的主要转录因子
滤泡辅助性T(Tfh)细胞是一群定位于淋巴滤泡的辅助性T细胞,表型为CD4+ CXCR5+ ICOS+ PD1+,是主要负责辅助B细胞产生抗体的T细胞亚群.多种转录因子对初始T淋巴细胞向各亚群细胞分化至关重要,包括B细胞淋巴瘤因子6(Bcl-6)、淋巴增强结合因子1(LEF-1)、T细胞因子1(TCF-1)、活化性T细胞的核因子(NFAT)、无刚毛鳞甲复合体同源物2(Ascl2)、干扰素调节因子4 (IRF4)、细胞肌腱膜纤维肉瘤因子(c-Maf)、B淋巴细胞诱导成熟蛋白1(Blimp1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)和信号转导与转录激活子(STAT)等.
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ASCL2在乳腺癌组织中的表达及其对患者预后的影响
目的:检测乳腺癌组织中转录因子ASCL2蛋白的表达情况,分析ASCL2蛋白表达与乳腺癌患者临床病理参数之间的关系,及其对乳腺癌患者预后的影响.方法:免疫组织化学SP法检测114例乳腺癌组织及其癌旁乳腺组织中ASCL2蛋白表达情况,分析ASCL2蛋白表达与乳腺癌患者临床病理参数的关系,分析癌组织中ASCL2蛋白表达与乳腺癌患者预后的关系.采用受试者工作特征曲线(ROC)法分析监测ASCL2蛋白表达对乳腺癌预后判断的灵敏度和特异度.结果:ASCL2蛋白在乳腺癌组织和癌旁乳腺组织中的阳性表达率分别为84.21%(96/114)和0.88%(1/114),差异有统计学意义(P＜0.05).乳腺癌组织中,ASCL2蛋白异常表达与患者的肿瘤直径、Ki67增殖指数和淋巴结转移有关(P均＜0.05),而与患者年龄、肿瘤分级、分子亚型和临床分期无关(P均＞0.05).ASCL2蛋白表达阳性患者的术后5年总生存率显著低于ASCL2蛋白表达阴性患者(P＝0.000).ROC分析结果显示,监测ASLCL2蛋白表达水平对患者生存预测有一定价值,曲线下面积(AUC)为0.925.结论:ASCL2在乳腺癌组织中高表达,且与肿瘤恶性进展和患者不良预后密切相关, ASCL2可作为乳腺癌预后预测和治疗的潜在靶点.
