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BAFF-R胞内区与TRAF3相结合关键分子结合域的确定
目的:研究BAFF-R胞内区与TRAF3相互作用的关键结合域.方法:分别钓取BAFF-R胞内区和TRAF3的cDNA片段,克隆到酵母双杂交系统中,验证两者之间的相互作用.利用缺失PCR和重叠PCR的方法获取11个TRAF3的突变体,验证TRAF3的11个突变体和BAFF-R胞内区的相互作用.结果:TRAF3与BAFF-R胞内区发生相互作用时,有三个关键的分子结合域,分别是N端的螺旋结构382-400位氨基酸、中间的428-463位氨基酸以及TRAF3C端的543-560位氨基酸.结论:在体内得到了BAFF-R胞内区与TRAF3相互作用的三个关键分子结合域,有助于展开对BAFF-R胞内区与TRAF3相互作用的进一步研究.
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大肠杆菌麦芽糖结合蛋白激活TLR2介导的MyD88依赖途径和TLR4介导的TRIF/TRAF3依赖途径诱导Th1活化
目的 探讨TLR2/TLR4介导的信号通路在大肠杆菌麦芽糖结合蛋白诱导Th1活化中的调控作用.方法 免疫磁珠分选方法获取纯的CD4+T细胞,经CD3/CD28抗体活化后的CD4+T细胞分别用MBP、MBP+anti-TLR2、MBP+anti-TLR4刺激.ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-4的分泌;RT-PCR检测CD4+T细胞IFN-γ、MyD88、TRIF、TRAF3和TRAF6的mRNA表达;Western blotting方法检测CD4+T细胞MyD88、TRIF、TRAF3和TRAF6的蛋白表达.结果 MBP组IFN-γ水平升高、IFN-γ、MyD88、TRIF、TRAF3的rnRNA上调、TRAF6的mRNA下调;MBP+anti-TLR2组IFN-γ水平降低、TRAF6的mRNA上调、MyD88的mRNA下调、TRIF、TRAF3的mRNA无影响;MBP+anti-TLR4组IFN-γ水平升高、TRAF6的mRNA上调、MyD88、TRIF、TRAF3的mRNA下调,Western blotting实验也出现了相似的结果.结论 TLR2介导的MyD88依赖途径和TLR4介导的TRIF/TRAF3依赖途径在MBP诱导的Th1活化过程中发挥了重要的调控作用.
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凋亡蛋白Daxx与TRAF3相互作用的筛选及相互作用位点的鉴定
目的:利用酵母双杂交技术在成人肝文库中筛选能与死亡结构域相关蛋白(Daxx)相互作用的蛋白,并用哺乳动物细胞中进行了免疫共沉淀验证,以进一步了解Daxx的功能. 方法: 利用PCR在成人肝cDNA文库中扩增Daxx全长ORF,构建pDBLeu-Daxx载体. 转化MaV203,检测细胞毒性和自激活作用,确定His基础表达的3AT浓度. 依次转化成人肝cDNA文库. 在营养缺陷型培养基上挑取三阳性克隆. 进行回转实验和免疫共沉淀验证,并利用β-gal分析进行了相互作用结构域的鉴定. 结果: 筛库转化效率达到5.8×106个克隆. 筛选到了一株能与Daxx相互作用的阳性克隆,DNA序列分析和同源检索表明该阳性克隆为肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3).通过回转及co-IP证实了TRAF3能与Daxx相互作用,β-gal分析发现TRAF3通过TRAF Domain与Daxx相互作用. 结论: TRAF3通过TRAF Domain与Daxx相互作用,可能参与了Daxx的调控和功能,为进一步了解Daxx作用的分子机制奠定了基础.
