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应用载体介导的RNAi技术抑制HBsAg在重组CHO细胞中的表达
目的应用载体介导的RNA干扰技术,特异地干扰重组CHO细胞中乙型肝炎病毒s基因的表达.方法设计两段靶向HBV s基因的特异性siRNA,合成两对64nt寡核苷酸,插入载体H1启动子下游,构建表达干扰性发夹状RNA(Short hairpin RNA,shRNA)的载体pHs-9和pHs-170,转染重组CHO细胞(该CHO细胞整合了HBV s基因,可稳定表达s抗原),用ELISA法检测HBsAg的表达.结果pHs-9和pHs-170转染重组CHO细胞后24～120 h,在细胞培养上清中检测到HBsAg表达降低,抑制率均达到70%左右.结论pHs-9和pHs-170已成功地表达了发夹状siRNA,并抑制了重组CHO细胞中HBsAg的表达.
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应用国产激流式生物反应器培养表达HBsAg的重组CHO细胞
目的 采用国产激流式生物反应器培养表达HBsAg的重组CHO细胞.方法 分别应用美国NBS公司的Celligen 310型生物反应器和国产AP20SC型激流式生物反应器(单个细胞培养袋和4个细胞培养袋)连续灌流培养重组CHO细胞,连续培养35 d,每24h收获1次,采用ELISA法测定细胞收获液中HBsAg的滴度.结果 Celligen 310型生物反应器培养重组CHO细胞分泌的HBsAg在2.0μg/ml水平上可持续8d,至第18天达高水平(2.16 μg/ml),第35天收液中HBsAg含量为1.12μg/ml;国产AP20SC激流式生物反应器单个细胞培养袋培养重组CHO细胞分泌的HBsAg在2.0μg/ml水平上可持续9d,第18天达高水平(2.20 μg/ml),第35天收液中HBsAg含量为1.08 μg/ml,与Celligen 310型生物反应器相比,收液中HBsAg含量在2.0μg/ml水平持续时间无明显差异；国产AP20SC激流式生物反应器4个细胞培养袋培养重组CHO细胞分泌的HBsAg在2.0μg/ml水平上可持续13d,与该生物反应器单个细胞培养袋相比明显延长,第21天达高水平(2.14 μg/ml),第35天收液中HBsAg含量为1.5μg/ml,明显高于单个细胞培养袋培养的细胞.结论 国产AP20SC型激流式生物反应器可代替进口生物反应器对传代细胞进行大规模培养,用于人用疫苗的生产.
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30 L生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂
目的 应用30 L填充床生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA).方法 将表达rht-PA的CHO细胞株用含10%胎牛血清的IMDM复苏并放大培养,接种至30 L生物反应器中,并采用Biocommand Plus 软件系统实时监控.先用含血清的培养基生长培养,再更换为无血清培养基进行表达培养.在整个培养过程中,采用灌流培养方式,每日采样测定培养上清中葡萄糖浓度,隔日测定rht-PA的表达水平及生物学活性.采用Lysine-Sepharose 4B和Zn~(2+)-Sepharose 4B两步亲和层析法纯化rht-PA,并检测纯化产物的比活、产率及纯度.结果 整个培养过程持续51 d,包括生长培养6 d,表达培养45 d,平均日灌流量为46.7 L,高达60 L,共收获表达培养液约2 100 L;rht-PA的平均表达水平为15.15 mg/L,高可达19.25 mg/L,生物学活性平均约为8 000 IU/ml;表达培养至第13天时,葡萄糖消耗量达高水平(15.97 g/L·d);纯化的rht-PA比活达6×10~5 IU/mg,产率为63%,纯度达99%以上.结论 应用30 L填充床生物反应器可实现重组CHO细胞的长时间连续培养及产物rht-PA的高效表达.
关键词： 人组织型纤溶酶原激活剂 重组CHO细胞 生物反应器 灌流培养 -
重组CHO细胞培养过程中代谢产物对细胞分泌HBsAg的影响
为了获得重组CHO细胞培养的佳条件,使其能连续高效表达HBsAg,以含不同量谷氨酰胺的DMEM溶液培养重组CHO细胞,测定了不同阶段氨基酸、氨、乳酸含量及HBsAg滴度.结果表明谷氨酰胺的分解产物氨与乳酸均能抑制细胞的生长和分泌HBsAg,减少细胞培养液中的谷氨酰胺用量可使HBsAg分泌量增加.
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重组CHO细胞C28株S基因序列的测定及分析
目的 测定重组CHO细胞C28株S基因序列,研究其遗传稳定性,并与已全基因序列测定的乙型肝炎病毒的S基因序列进行比较分析,预测和揭示现有疫苗株对当前疾病流行株的防病效果.方法 从C28株中选取第22代、24代、25代、27代、28代、29代、30代、31代、32代、33代和34代细胞,根据GenBank中C基因型adr亚型乙型肝炎病毒的全基因序列设计引物.采用酚-氯仿法抽提CHO细胞基因组DNA,用PCR法扩增各代次细胞的S基因,回收700 bp左右的目的片段,克降至pMD18-T载体上进行序列测定.利用生物学软件MEGA4.1和BioEdit进行S基因序列同源性分析,绘制系统进化树,分析与其他HBV病毒株S基因的同源性.应用实验动物测定C28株生产的重组乙型肝炎疫苗的效价.结果 C28株十一个代次之间S基因序列核苷酸和氨基酸同源性均为100％；C28株十一个代次S基因与其他病毒株S基因比较,与C基因型乙型肝炎病毒同源性高,与其他基因型乙型肝炎病毒的核苷酸同源性达91.4％～95.1％,氨基酸同源性达84.5％ ～ 93.3％.免疫NIH小鼠结果显示5批重组乙型肝炎疫苗的效价均符合标准.结论 C28株S基因在传代及保存过程中具有较高的稳定性,对当前疾病流行株有较好的防病效果.
