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运送蛋白IFT70文献资料
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莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT70的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备
目的 原核表达及纯化莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT70,并制备其多克隆抗体.方法 以质粒pGAD-ift70(含莱茵衣藻 ift70基因N-末端编码380个氨基酸的核酸序列)为模板,分别构建带有6×His和MBP标签的原核表达质粒pET-28A-ift70和pMAL-C2X-ift70,转入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达6×His-IFT70和MBP-IFT70融合蛋白,并进行亲和层析.将纯化的MBP-IFT70融合蛋白免疫2只新西兰大白兔,经耳动脉采血,分离血清,ELISA法测定抗体效价,经两步亲和纯化后进行Western blot及免疫荧光法分析.结果 经双酶切及测序鉴定证明原核表达质粒pET-28A-ift70和pMAL-C2X-ift70构建正确.6×His-IFT70和MBP-IFT70融合蛋白的相对分子质量分别为40 000和80 000,纯化后纯度可达90％.家兔1及家兔2抗血清的效价分别为＞128 000及＞256 000,纯化的抗血清可与莱茵衣藻IFT70蛋白发生特异性结合,于相对分子质量约70 000处可见特异性结合条带,可与野生型莱茵衣藻CC-125纤毛上的IFT70蛋白发生特异反应,荧光显微镜下可见红色荧光.结论 成功制备了抗莱茵衣藻IFT70的多克隆抗体,为IFT70在IFT和纤毛组装中作用的深入研究奠定了基础.
