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转导骨桥蛋白短发夹状RNA预防动脉粥样硬化模型兔血管成形后的再狭窄
背景：血管成形后再狭窄严重限制了经皮冠状动脉介入治疗的应用和远期疗效。平滑肌细胞的表型转变，增殖是血管成形后再狭窄的重要机制。
目的：探讨利用球囊在体转导骨桥蛋白短发夹状RNA，通过抑制实验性动脉粥样硬化模型兔损伤血管部位骨桥蛋白的表达，预防血管成形后再狭窄。
方法：构建动脉粥样硬化模型兔20只，随机等分成空质粒组和OPN-shRNA质粒组，分别利用球囊在腹主动脉导入OPN-shRNA质粒和空载体。
结果与结论：2组兔球囊扩张后血管平滑肌层出现特异性绿色荧光，且随转染后时间的延长荧光强度逐渐降低，与空质粒组相比，OPN-shRNA 质粒组兔扩张动脉的管腔面积明显增加，而斑块负荷明显减小。提示在动脉粥样硬化兔模型局部血管利用球囊导管能成功地转导OPN-shRNA质粒，被扩张血管的再狭窄程度减轻，血栓负荷减轻。这对于预防模型兔血管成形后再狭窄的发生具有十分重要的意义。 -
靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选
目的 构建编码hVEGF165 mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果明显的shRNA质粒表达载体.方法 以hVEGF165 mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定.经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果.结果 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功.靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2为明显.结论 成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒.
关键词： RNA干扰 质粒表达载体 短发卡样RNA hVEGF165基因 -
携带靶向干扰VEGF基因shRNA重组腺相关病毒载体的构建和制备
目的:构建并制备携带靶向干扰VEGF165基因shRNA的重组腺相关病毒载体.方法:将PCR法扩增所得EGFP-U6-shRNA(VEGF165)片段插入载体质粒pSNAV2.0-lacz-α的EcoRI和SalI酶切位点,构建重组质粒pSNAV2.0-EGFP-U6-shRNA(VEGF165).以HSV1-RapCap/△UL2为辅毒,包装rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF165)病毒.对所获病毒载体进行PCR,SDS-PAGE鉴定分析、滴度测定和EGFP的活性检测.结果:PCR,SDS-PAGE鉴定分析结果表明靶向干扰VEGF165基因的shRNA片段成功包装入重组AAV2载体,病毒纯度在98%以上.点杂交法测定重组病毒载体基因组滴度约为3×1014 v.g.(vector genomes)/L. EGFP活性检测显示重组AAV2感染细胞阳性率在30%以上.结论:成功制备了rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF165)病毒载体,为通过RNA干扰技术特异性抑制VEGF基因的表达来阐明VEGF在缺血性脑损伤后各种生物学事件中的作用奠定了实验基础.
