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靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选
背景:已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达.尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究.目的:创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果明显的短发夹样RNA表达质粒.设计、时间及地点:基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成.材料:人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所.方法:设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段.构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1-4)并行酶切鉴定分析.然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率.主要观察指标:重组质粒酶切鉴定结果.转染效率.采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达.结果:成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,其中抑制效果为明显的短发夹样RNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒.重组质粒经酶切鉴定证实构建成功.质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%.短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率高,可达86%.结论:成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用.短发夹样RNA2表达质粒抑制作用明显.
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RNA干扰抑制胆囊癌血管内皮细胞生长因子的实验研究
目的:构建编码胆囊癌VEGF基因的短发夹状RNA(shRNA),观察shRNA干扰对胆囊癌血管内皮细胞表达的影响.方法:根据人VEGF基因的序列选择了4个位,设计shRNA,制备VEGF-shRNA质粒表达栽体,并进行测序分析.将重组质粒转染到胆囊癌细胞GBC-SD中,采用荧光PCR检测VEGF-mRNA表达情况,ELISA法及Western-blot法检测VEGF蛋白含量.结果:成功构建了靶向VEGF基因的shRNA质粒表达栽体,并经测序验证.实时荧光PC分析shRNA2抑制VEGF基因的mRNA表达,抑制率可达86%.由ELISA法及Western-blot法看出ShVEGF-1、ShVEGF-2、ShVEGF-3、ShVEGF-4中VEGF的表达得到明显的抑制,且Sh-VEGF-4效果显著(P<0.05),而NC细胞(阴性对照)则基本没有抑制VEGF的表达(P>0.05).结论:成功构建靶向VEGF的shRNA表达质粒,其对胆囊癌血管内皮细胞表达具有明显抑制作用.
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杜氏盐藻荧光素酶基因表达载体的构建
目的:构建盐藻荧光素酶基因表达载体.方法:分别用合适的限制性内切酶消化载体pGL3-Enhancervector、pD-B、pMD-CA和pMD-rbcs,胶回收适当的片段,T4 DNA连接酶过夜连接,转化宿主菌大肠杆菌JM109.挑取阳性克隆,提取质粒DNA,酶切鉴定.结果:得到含盐藻自身启动子碳酸酐酶(CA)基因启动子、双倍重复碳酸酐酶(DCA)基因启动子和来自衣藻的1,5二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(rbcs)基因启动子,以及荧光素酶(Luc)基因为外源基因的3个盐藻表达载体.结论:构建了3个杜氏盐藻荧光素酶表达载体.
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靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选
目的 构建编码hVEGF165 mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果明显的shRNA质粒表达载体.方法 以hVEGF165 mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定.经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果.结果 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功.靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2为明显.结论 成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒.
关键词： RNA干扰 质粒表达载体 短发卡样RNA hVEGF165基因 -
赖型钩体flaB2与VR1012中的CpG基序分析
目的对问号赖型钩端螺旋体(赖型钩体)DNA疫苗[包括内鞭毛蛋白基因(flaB2)和质粒DNA表达载体(VR1012)]的CpG基序(CpG motifs)进行分析,为DNA疫苗免疫机制的阐明和提高DNA疫苗的效能奠定基础.方法以flaB2与VR1012构建重组DNA的免疫原,对flaB2及VR1012全核苷酸序列进行计算机分析(分类、计数和定位).结果 CpG的"C"的侧翼为两个嘌呤,"G"的侧翼为两个嘧啶,在flaB2中共3个,分别为GACGCT,GACGTC和GACGCC;在VR1012中共11个,分别为GACGTC 1个,GACGCT 2个,GACGCC 1个,GACGTT 1个,GGCGTT 2个,GGCGCT 2个,GGCGCC 1个,AACGCT 1个,其中特别重要的TGACGTCA 4个和TAACGCCA有1个,位于5′端456～463;509～516;592～599;778～785和486～493;4个TGACGTCA和1个TAACGCCA均位于5′端且相对集中.结论赖型钩体flaB2与VR1012 构成的DNA疫苗含有TGACGTCA等CpG,这些基序又称免疫刺激序列,构成了DNA疫苗中的佐剂.
