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大鼠肺泡II型上皮细胞系RAE-1的建立及其生物学特性
建立肺泡II型细胞系为研究细胞恶性转化提供实验模型.采用Nycodenz密度梯度离心法分离了大鼠肺泡II型上皮细胞,原代培养大鼠肺泡II型上皮细胞并将SV40病毒的早期区大T基因转导入上皮细胞,建立了可在体外长期稳定传代的细胞系RAE-1.对此细胞系的生物学特性分析表明:细胞的基因组中整合了SV40T基因;染色体分析以非整倍体为主,众数染色体为44条;细胞不能在软琼脂上形成克隆;除了转化特性以外,RAE-1细胞仍保留了正常的上皮组织角蛋白Ck8、Ck18的表达.
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SV40大T抗原在人脑肿瘤中与p53形成特异性复合物
目的探讨SV40早期区域基因编码产物大T抗原(Tag)表达及与抑癌蛋白p53的相互作用在人脑肿瘤发生发展中的意义。方法采用免疫共沉淀及Western印迹法检测43例人脑肿瘤组织及5例正常人脑组织中Tag的表达，并对18例Tag阳性瘤组织检测Tag-p53复合物的存在。结果 Tag在5例室管膜瘤及2例脉络丛乳头状瘤中全部表达，垂体腺瘤(5/6)、星形胶质细胞瘤(7/10)、脑膜瘤(4/6)、多形性胶质母细胞瘤(3/5)及髓母细胞瘤(2/5)均有Tag的表达，3例少枝胶质细胞瘤、1例松果体瘤及5例正常人脑组织无Tag表达；检测18例Tag阳性瘤组织均发现Tag与p53形成特异性复合物。结论在人脑肿瘤组织中Tag广泛表达，Tag可与p53形成特异性复合物，Tag-p53特异性复合物的形成导致p53失活，可能是SV40致人脑肿瘤发生的一个重要机理。
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SV40T抗原胃壁细胞特异性表达载体的构建与鉴定
目的:构建在胃壁细胞中特异性表达SV40T抗原的真核表达载体并进行鉴定.方法:采用酚-氯仿法从昆明小鼠肝细胞中提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增H+/K+ATPase β亚基启动子,产物命名为HK.将PCR产物纯化回收后与pMT18-T载体相连,并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK;从含SV40T基因片段的质粒pLITAg中酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,并测序鉴定.结果:pcDNA3.1(-)/HKSV用Xba Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切可得到1 kb H+/K+ATPase β亚基启动子,2.7 kb SV40T基因与5.4 kb pcDNA3.1(-)载体3条DNA条带.用Xba Ⅰ、Kpn Ⅰ双酶切电泳,可见到约3.7与5.4 kb的两条DNA条带;用BamH Ⅰ单酶切电泳,可见到2.7与6.4 kb的2条DNA条带;用EcoR Ⅰ单酶切,只见到约9.1 kb的1条DNA条带,酶切电泳结果均与设计一致.测序结果显示,H+/K+ATPase β亚基启动子与SV40T基因成功构建于pcDNA3.1(-)真核表达载体中.结论:构建在胃壁细胞中特异性表达SV40T基因的真核表达载体,为进一步转基因小鼠及胃癌动物模型的建立提供了稳定、可靠的分子工具.
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SV40病毒T抗原真核载体的构建与表达
目的设计、构建SV40病毒T抗原真核表达载体,并导入真核细胞进行表达鉴定. 方法采用重叠延伸拼接法,从pUC19-SV40载体中亚克隆切除内含子的SV40病毒T抗原基因全长片段,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体上,酶切鉴定重组质粒;用脂质体转染的方法将构建的载体导入原代培养的正常人成纤维细胞进行表达,检测SV40病毒T抗原基因在成纤维细胞内的表达. 结果 SV40病毒T抗原基因成功克隆至pEGFP-N1真核表达载体中;转染成纤维细胞提取基因组DNA及总RNA,分别经PCR和RT-PCR反应扩增出288 bp的特异性片段. 结论本试验构建的SV40病毒T抗原重组质粒为利用SV40T抗原进行真核细胞研究提供了稳定、可靠的分子工具.
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恒河猴外周血及肾组织SV40病毒基因分析
SV40即猿猴病毒40(simian virus 40),是DNA肿瘤病毒的原型代表,其基因结构为共价闭合环状双股DNA分子,标准参考株SV40-776含5243个核甘酸,不同分离株bp数略有差异.
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具有软骨细胞表型特征的永生化兔髁突软骨细胞系的建立
目的:建立具有稳定软骨细胞表型特征的永生化兔髁突细胞系.方法:采用逆转录病毒载体介导的方法将SV40大T抗原基因导入原代培养的兔髁突软骨细胞,利用G418筛选阳性克隆并对其进行扩大培养,通过RNA点杂交检测转基因细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原基因的转录.结果:有一株克隆在体外1年半稳定传代100次以上,命名为永生化髁突软骨细胞系(immortalized mandibular condylar chondrocyte,IMCC),点杂交显示IMCC有Ⅰ、Ⅱ型前胶原基因的转录.结论:获得具有稳定软骨细胞表型特征的永生化兔髁突细胞系.
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体外长期培养人转化角朊细胞系的生物学特征
目的:研究SV40病毒转化的人角朊细胞系在体外长期培养过程中的细胞生物学特征.方法:采用细胞培养法观察转化细胞系的克隆形成率、细胞生命曲线以及血清、Ca2+对其生长分化的影响.结果:与正常角朊细胞相比,转化角朊细胞系于体外形成克隆所需的低接种密度有所降低,但接触抑制特性仍未丧失.转化细胞在体外已传代培养25代,对血清的依赖性降低,可被Ca2+诱导分化而形成细胞膜片结构.结论:本研究所观察的转化细胞系可在体外长期传代培养,并保留了正常角朊细胞的部分生物学特征,该细胞系在创面修复研究中具有一定价值.
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SV40病毒对体外培养的人角朊细胞的转化
目的:研究SV40(simianvirus40)病毒对人角朊细胞的体外转化作用以及转化后细胞生物学特性的改变.方法:采用体外共培养法以SV40野生型病毒感染人包皮角朊细胞,观察病毒基因在细胞内的表达以及细胞表型的改变情况.结果:分离获得了可长期体外培养的SV40转化细胞克隆,已传23代以上,体外存活超过250d;DNA印迹实验显示SV40大T基因已整合至细胞染色体内,间接免疫荧光检测示多数细胞胞核内有大T基因产物的表达;转化细胞对裸鼠无致瘤性,并可正常表达角蛋白.结论:SV40病毒转化人角朊细胞后可使其在体外长期培养,该细胞的获得为进一步研究外源性基因对角朊细胞生长的调控奠定了基础.
