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低剂量三氯乙烯诱导人正常肝细胞损伤耐受差异表达基因的研究
目的寻找低剂量三氯乙烯(TCE)诱导人正常肝细胞(L-02)损伤耐受差异表达的基因.方法参照本实验室用MTT法所得的TCE对L-02毒性剂量-效应关系,选择5μmol/L的三氯乙烯为低剂量,40μmol/L为高剂量,按以下方式对细胞进行染毒:空白对照、低剂量、高剂量、损伤耐受组(先用低剂量刺激24小时,再用高剂量刺激6小时),然后用荧光差异显示PCR(Fluoro DD-PCR)寻找不同方式刺激差异表达的基因,并对差异表达基因进行克隆、鉴定.结果按方法所示的方式处理细胞,处理完毕后提取各组细胞总RNA,进行荧光差异显示PCR,找到51个差异条带.对其中的11个差异条带进行克隆鉴定同源性比较,发现其中9个已知基因,2个新基因.结论用荧光差异显示PCR方法寻找TCE诱导L-02损伤耐受过程差异表达的基因,通过鉴定基因,为进一步研究TCE诱导L-02的损伤耐受的机理提供科学依据.
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低剂量的甲醛诱导MRC-5损伤耐受差异表达基因的研究
目的用荧光差异显示PCR(fluoro DD-PCR)方法寻找低剂量的甲醛(FA)诱导人胚肺成纤维细胞(MRC-5)损伤耐受差异表达的基因.方法用MTT方法得到FA对MRC-5毒性的剂量-反应关系.根据剂量-反应关系选择对MRC-5几乎没有损伤或有增殖的剂量作为低剂量,对细胞有明显损伤的剂量为高剂量,然后用低剂量、高剂量、损伤耐受模式(低剂量预刺激后继而用高剂量刺激)三种方式处理细胞,通过荧光差异显示PCR技术寻找不同处理组与对照组比较差异表达的基因.对其中的11个差异条带进行二次PCR、克隆、测序,在GeneBank上通过Blast鉴定基因.结果根据FA对MRC-5毒性的剂量-反应关系,选择100μmol/L为低剂量、10mmol/L为高剂量.然后按方法中所述的方式处理细胞后,用荧光差异显示PCR的方法发现有61个差异表达的基因.对其中的11个差异条带进行鉴定,发现有2个已知基因,分别与nuclear factor of activated T-cells 5(NFAT5)和tetratricopeptide repeat domain3(TPRD-3)高度同源,其余9个为新基因.结论FA在低剂量可以促进MRC-5的增殖,通过荧光差异显示PCR获得61个FA诱导MRC-5损伤耐受差异表达的基因,通过对其中11个差异条带的鉴定,为进一步研究FA诱导MRC-5损伤耐受的机制提供线索.
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心脏移植后外周血FK506结合蛋白1A基因的表达
利用荧光差异显示PCR(DD-PCR)技术检测心脏移植后外周血白细胞基因的表达.结果显示:RPL23基因移植后有波动,排斥发生时表达增强;FK506结合蛋白1A基因移植后表达较弱,排斥发生时明显增强.提示:外周血DD-PCR检测白细胞基因的表达可能对研究排斥反应机制及进行移植排斥反应诊断具有一定的意义.
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低剂量过氧化氢诱导机体适应性反应差异表达基因的研究
目的寻找低剂量过氧化氢(H2O2)诱导人胚肺成纤维细胞(MRC-5)适应性反应差异表达的基因.方法用溴化四氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活率得到H2O2对MRC-5毒性的剂量反应关系,分别用低剂量、高剂量和低剂量预刺激后用高剂量攻击细胞,观察细胞生长的变化,得到低剂量H2O2诱导MRC-5的适应性反应模型.然后用荧光差异显示聚合酶链反应(Fluoro DD-PCR)寻找不同方式刺激的差异表达基因.结果根据H2O2诱导MRC-5毒性的剂量反应关系,选择0.088、0.88、8.8、88μmol/L为低剂量,1 100μmol/L为高剂量,用低剂量处理细胞24 h,然后用高剂量刺激1 h,可以观察到在0.88μmol/L预刺激细胞24 h后,对继而1 100μmol/L的刺激有明显的抵抗效应.对不同方式处理的细胞RNA进行Fluoro DD-PCR,找到60个差异条带.对其中的15个差异条带进行克隆鉴定同源性比较,发现其中7个已知基因,8个新基因.结论H2O2可以诱导MRC-5的适应性反应过程,用Fluoro DD-PCR方法找到差异表达的基因.
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低剂量的氢醌诱导细胞损伤耐受差异表达基因的研究
目的 探讨低剂量氢醌(HQ)诱导人胚肺成纤维细胞(HLF)损伤耐受差异表达的基因.方法 参照本实验室用MTT法所得的HQ对HLF毒性的剂量效应关系,选择100 pmol/L的HQ为低剂量,100μmol/L的HQ为高剂量,按以下方式对细胞进行染毒:空白对照、低剂量、高剂量、损伤耐受组(先用低剂量预刺激24 h,再用高剂量刺激6 h,然后用荧光差异显示PCR寻找不同方式刺激差异表达的基因,并对差异表达基因进行克隆、鉴定同源性比较.结果 按方法所示的方式处理细胞,处理完毕后提取各组细胞总RNA,进行荧光差异显示PCR,找到33个差异条带.对其中的8个差异条带进行克隆鉴定同源性比较,发现其中1个已知基因,7个未知基因.结论 用荧光差异显示PCR方法寻找HQ诱导HLF损伤耐受过程差异表达的基因,通过鉴定基因,为进一步研究低剂量HQ诱导HLF损伤耐受的机制提供科学依据.
