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低剂量三氯乙烯诱导人正常肝细胞损伤耐受差异表达基因的研究
目的寻找低剂量三氯乙烯(TCE)诱导人正常肝细胞(L-02)损伤耐受差异表达的基因.方法参照本实验室用MTT法所得的TCE对L-02毒性剂量-效应关系,选择5μmol/L的三氯乙烯为低剂量,40μmol/L为高剂量,按以下方式对细胞进行染毒:空白对照、低剂量、高剂量、损伤耐受组(先用低剂量刺激24小时,再用高剂量刺激6小时),然后用荧光差异显示PCR(Fluoro DD-PCR)寻找不同方式刺激差异表达的基因,并对差异表达基因进行克隆、鉴定.结果按方法所示的方式处理细胞,处理完毕后提取各组细胞总RNA,进行荧光差异显示PCR,找到51个差异条带.对其中的11个差异条带进行克隆鉴定同源性比较,发现其中9个已知基因,2个新基因.结论用荧光差异显示PCR方法寻找TCE诱导L-02损伤耐受过程差异表达的基因,通过鉴定基因,为进一步研究TCE诱导L-02的损伤耐受的机理提供科学依据.
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低剂量的甲醛诱导MRC-5损伤耐受差异表达基因的研究
目的用荧光差异显示PCR(fluoro DD-PCR)方法寻找低剂量的甲醛(FA)诱导人胚肺成纤维细胞(MRC-5)损伤耐受差异表达的基因.方法用MTT方法得到FA对MRC-5毒性的剂量-反应关系.根据剂量-反应关系选择对MRC-5几乎没有损伤或有增殖的剂量作为低剂量,对细胞有明显损伤的剂量为高剂量,然后用低剂量、高剂量、损伤耐受模式(低剂量预刺激后继而用高剂量刺激)三种方式处理细胞,通过荧光差异显示PCR技术寻找不同处理组与对照组比较差异表达的基因.对其中的11个差异条带进行二次PCR、克隆、测序,在GeneBank上通过Blast鉴定基因.结果根据FA对MRC-5毒性的剂量-反应关系,选择100μmol/L为低剂量、10mmol/L为高剂量.然后按方法中所述的方式处理细胞后,用荧光差异显示PCR的方法发现有61个差异表达的基因.对其中的11个差异条带进行鉴定,发现有2个已知基因,分别与nuclear factor of activated T-cells 5(NFAT5)和tetratricopeptide repeat domain3(TPRD-3)高度同源,其余9个为新基因.结论FA在低剂量可以促进MRC-5的增殖,通过荧光差异显示PCR获得61个FA诱导MRC-5损伤耐受差异表达的基因,通过对其中11个差异条带的鉴定,为进一步研究FA诱导MRC-5损伤耐受的机制提供线索.
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低剂量的氢醌诱导细胞损伤耐受差异表达基因的研究
目的 探讨低剂量氢醌(HQ)诱导人胚肺成纤维细胞(HLF)损伤耐受差异表达的基因.方法 参照本实验室用MTT法所得的HQ对HLF毒性的剂量效应关系,选择100 pmol/L的HQ为低剂量,100μmol/L的HQ为高剂量,按以下方式对细胞进行染毒:空白对照、低剂量、高剂量、损伤耐受组(先用低剂量预刺激24 h,再用高剂量刺激6 h,然后用荧光差异显示PCR寻找不同方式刺激差异表达的基因,并对差异表达基因进行克隆、鉴定同源性比较.结果 按方法所示的方式处理细胞,处理完毕后提取各组细胞总RNA,进行荧光差异显示PCR,找到33个差异条带.对其中的8个差异条带进行克隆鉴定同源性比较,发现其中1个已知基因,7个未知基因.结论 用荧光差异显示PCR方法寻找HQ诱导HLF损伤耐受过程差异表达的基因,通过鉴定基因,为进一步研究低剂量HQ诱导HLF损伤耐受的机制提供科学依据.
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肝纤维化抵抗对乙酰氨基酚诱导的致死性损伤及其机制
目的 证明四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化能够保护小鼠抵抗致死性对乙酰氨基酚(APAP)攻击,并初步探讨其发挥保护作用的机制. 方法 建立CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型,于纤维化6周时以致死剂量的APAP(1 g/kg)进行攻击,以同样处理的正常小鼠作为对照.即实验共分为4组:对照组、急性损伤组(APAP组)、肝纤维化组(Fib组)、肝纤维化+急性攻击组(Fib+APAP组),每组5只.根据攻击前后小鼠生存率、转氨酶水平及肝组织学的变化来评估正常和纤维化小鼠对致死性APAP损伤的耐受性.免疫组织化学法分析各组小鼠肝组织中高迁移率族蛋白1(HMGB1)的表达.组间差异的比较采用One-way ANOVA分析和Newman-Keuls检验. 结果 接受APAP攻击的纤维化小鼠的肝损害程度明显轻于同样处理的正常小鼠,表现为:(1) Fib+APAP组小鼠的生存率明显高于APAP组(80％对比0); (2) Fib+APAP组小鼠的sALT升高水平显著低于APAP组[(6437±1 913) U/L对比(12 456±3 441) U/L],P=0.022,攻击前后,正常小鼠的sALT水平升高了257.4倍,而纤维化小鼠则仅升高了12.2倍;(3) Fib+APAP组的肝组织学检查结果较APAP组明显改善.免疫组织化学分析结果表明,APAP组小鼠肝组织中HMGB1呈高表达,并且可见明显的HMGB1由胞核向胞质转位,而Fib+APAP组HMGB1的表达明显弱于APAP组,且胞质转位少见.结论 CCl4诱导的肝纤维化可能通过限制HMGB1的胞质转位及其所触发的损伤效应而保护小鼠抵抗致死性APAP的攻击.
