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EB病毒转化的永生性人B淋巴母细胞中MTHFR基因的表达
为检测用EB病毒转化建立的永生性人B淋巴母细胞株中N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的表达及其cDNA序列,用EB病毒转化人外周血B淋巴细胞,建立永生性细胞株后,从培养细胞中提取总RNA,用RT-PCR法扩增MTHFR基因cDNA的不同片段,进行PAGE电泳分析和cDNA序列测定.结果显示永生性人B淋巴母细胞中有MTHFR基因表达,其cDNA序列与文献报道的人肝脏MTHFR基因cDNA序列一致.
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抗-D单克隆抗体的研制及其应用
目的研制用于Rh(D)分型的抗-D单克隆抗体.方法以EB病毒(EBV)转化能分泌抗-D抗体的Rh阴性供者的B淋巴细胞,用酶处理RhD+、O型红细胞富集抗-D分泌细胞,并用有限稀释法克隆.采用一步酶法,于96孔微量板中分别用阳性细胞培养上清液和人源多克隆抗-D血清及进口的单克隆抗-D血清平行检测1 000名献血员的Rh(D)血型.结果建立了3株能分泌抗-D抗体的人B淋巴细胞株,其中1株分泌的抗体为lgM,2株为lgG;抗体效价在64～128之间;3种试剂检测Rh(D)血型的符合率为100%,3名献血员均为RhD-.结论抗-D单克隆抗体可用于Rh(D)分型.
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用EBV转化的肝癌患者B细胞构建噬菌体单链抗体库
目的 构建抗肝癌人源噬菌体单链抗体库.方法 体外致敏并用EBV转化肝癌患者的PBMC.用PCR分别扩增VH和VL基因并组成ScFv基因.将ScFv基因与载体连接后,转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型ScFv库.结果 经EBV转化的4例肝癌患者PBMC,ELISA检测均有抗肝癌抗体产生,经多次PCK,扩增出6种vH(γ、μ)和9种VL(κ、λ)基因,经连接组成54种ScFv基因.将ScFv基因与载体连接后.导入大肠杆菌MC1 061.经四环素抗性筛选,得到库容为1.0×108的初级噬菌体抗独特型抗体库,噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为80%.结论 用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术,制备全人源抗肿瘤单链抗体(ScFv),这一策略是完全可行的.
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EBV转化B型健康人B淋巴细胞构建噬菌体抗体库
目的构建人源抗红细胞A抗原单链噬菌体抗体库.方法应用EB病毒转化方法和噬菌体抗体库技术,从EB病毒转化成功的B型个体淋巴细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一条链,PCR分别扩增VH和Vκ基因,经重叠延伸拼接法(SOE)组成ScFv基因并将其克隆入pCANTAB5E,转化E.coli TGI,加入辅助噬菌体M13KO7援救,构建人源抗红细胞A抗原单链噬菌体抗体库,并测定文库的库容、滴度及ScFv基因的插入率.使用完整A型红细胞对该库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选,细胞ELISA、红细胞血凝实验对所获抗体进行初步鉴定.结果所构建的噬菌体抗体库,其库容为1.2×106,噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为0.90,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为2.52×1010PFU/mL的初级噬菌体抗体库.以完整A型红细胞进行四轮淘筛,出现特异性富集.经细胞ELISA、红细胞血凝实验鉴定,得到2株与A型红细胞特异结合的ScFv噬菌体抗体.结论EB病毒转化方法联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库切实可行,可进行亲和筛选以得到人源抗红细胞A抗原的基因工程抗体.
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EB病毒转化B淋巴母细胞在汉滩病毒CTL表位研究中的应用
目的:建立EB病毒转化B淋巴母细胞系(B-LCL),作为抗原提呈细胞(APC)提呈抗原肽,刺激短期培养的特异性T细胞活化并分泌IFN-γ,从而应用于T细胞表位鉴定中.方法:用B95-8细胞培养上清中的EB病毒转化肾综合征出血热(HFRS)患者PBMC,建立HFRS患者的B-LCL,以自身BLCL为APC,加载抗原肽后,刺激短期培养的G9L特异的HFRS患者CD8+ T细胞系,应用ELISPOT测定CD8+ T细胞受到抗原肽刺激后产生IFN-γ的能力.结果:加载过抗原肽G9L或V15R的B-LCL可刺激G9L特异的CD8+ T细胞活化并产生IFN-γ,而与G9L无同源序列的115P则不能刺激G9L特异的CD8+ T细胞活化.结论:B-LCL可作为非专职APC有效地将抗原肽提呈给特异性T细胞.
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全人源抗肝癌噬菌体单链抗体的筛选与鉴定
目的: 构建人源抗肝癌噬菌体单链抗体库, 从中筛选抗肝癌单链抗体(scFv), 并对其特异性进行鉴定.方法: 采用体外致敏法和EBV转化技术联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库.对初级抗体库进行亲和富集及ELISA筛选, 获得的阳性克隆进行免疫组化鉴定并测序.结果: scFv基因与载体连接后得到库容量为1.0×108的初级噬菌体抗体库.对抗体库进行3轮正负淘选和富集后, 随机挑取2 798个克隆进行ELISA, 发现3个克隆对HepG2呈强阳性反应, 而与QSG-7701等人正常细胞系呈弱阳性或不反应.对克隆SA3进行免疫细胞化学鉴定, 结果与ELISA一致.免疫组织化学鉴定表明SA3与肝癌组织和肝组织阳性率的差别有统计学意义.结论: 构建了库容量达1×108的全人源抗肝癌噬菌体抗体库.通过淘选富集、 ELISA和免疫组织化学鉴定获得特异性较强的噬菌体克隆, 为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础.
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用EBV转化的大肠癌患者B细胞构建噬菌体抗体库
目的构建全人源化的噬菌体抗体库。方法采用EBV转化技术，ELISA技术，PCR技术，噬菌体表面呈现技术。结果 EBV转化8例大肠癌患者PBMC，其中七例有抗大肠癌抗体产生，多次PCR扩增出5种VH(γ,μ)和9种VL(к,λ)基因，经简并组合成15种ScFv基因。在体外与表达载体fUSE5连接，电导入大肠杆菌MC1061，经四环素抗性筛选，得到库容为1.1×107的初级噬菌体抗体库。全长ScFv基因的插入率为70％。结论应用EBV转化技术联合噬菌体抗体库技术，制备全人源化的抗肿瘤单链抗体(ScFv)，这一策略是完全可行的。
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用体外致敏联合EB病毒转化技术构建抗肝癌的人源Fab噬菌体抗体库
目的 构建抗肝癌的人源Fab噬菌体抗体库.方法 体外致敏并用EB病毒(EBV)转化肝癌患者的外周血单个核细胞(PBMC).RT-PCR扩增人抗体轻链和重链Fd段基因,将抗体基因分别与载体pComb3连接后,电转化大肠杆菌XLI-Blue,构建噬菌体呈现型Fab抗体库.结果 经EBV转化的4例肝癌患者PBMC,ELISA检测均有抗肝癌抗体产生;经PCR扩增出13条轻链基因片段(κ、λ)和28条重链Fd基因片段(γ);电转化构建的噬菌体抗体库库容为1.7×107puf/mL;Fab基因的重组率约为100%.结论 用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术,成功构建了全人源抗肝癌Fab组合抗体文库.
