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氪激光诱导大鼠脉络膜新生血管基因芯片研究
目的运用基因芯片技术研究氪激光诱导大鼠脉络膜新生血管的差异表达基因,为脉络膜新生血管的治疗提供实验依据. 方法氪激光光凝视网膜后7 d,分别提取实验组和对照组脉络膜组织的总RNA,将纯化后的mRNA进行反转录,制备杂交探针,应用含有5 705 条Oligo DNA的表达谱芯片对实验组和对照组脉络膜组织进行差异表达基因检测. 结果氪激光诱导脉络膜新生血管组织的差异表达基因共有427条,其中上调基因为189条,下调基因为23 8条.上调高的基因是MMP12基因.在差异表达基因中有代谢、细胞粘附、细胞运动、发育、运输、信号传导、分化等基因. 结论氪激光诱导脉络膜新生血管的发生发展涉及多基因改变.
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激光损伤对BN大鼠视网膜缝隙连接蛋白Cx43分布的影响
目的探讨细胞间隙连接蛋白(connexin 43,Cx43)在(Brown Norway,BN)大鼠视网膜中的分布特点以及氪激光损伤视网膜后Cx43分布的变化.方法应用雄性BN为研究对象,氪红激光眼底光凝(波长647 nm,能量360 mW,光斑直径50 μm,曝光0.05 s).右眼视盘周围10个激光点.光凝后1周开始取材,应用免疫组化方法观察Cx43在BN大鼠视网膜中的分布特点.结果正常视网膜内界膜、视神经纤维层以及神经节细胞层明显表达,神经节细胞表达的主要位置是细胞浆和细胞膜,色素上皮细胞全层表达,内外颗粒层及内外丛状层无表达.激光损伤后的内界膜,视神经纤维层以及神经节细胞层Cx43表达明显减少,瘢痕区视网膜色素上皮细胞接近消失,而激光斑周边色素上皮细胞表达不受影响,激光斑部位增殖的成纤维样细胞部分表达.结论正常视网膜的Cx43主要分布在内界膜、神经纤维层、视网膜节细胞层和视网膜色素上皮层,激光损伤后内界膜、视神经纤维层以及神经节细胞层表达减弱,激光斑周围色素上皮细胞中表达无明显变化,激光损伤瘢痕中的成纤维细胞有少量表达.
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MEK/ERK和PI3K/Akt通路对大鼠脉络膜新生血管中DDR2和MMP-13表达的调控作用
背景 研究表明盘状结构域受体2(DDR2)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)在肿瘤新生血管发生中具有重要作用,是相关疾病治疗的关键靶点,但DDR2和MMP-13在脉络膜新生血管(CNV)发生中的作用尚不清楚.目的 探讨DDR2和MMP-13在大鼠CNV中的表达特点以及MEK/ERK和PI3 K/Akt通路对DDR2及MMP-13表达的调控作用.方法 采用532 nm倍频激光视网膜光凝法制备棕色挪威(BN)大鼠CNV模型,将78只BN模型鼠按照随机数字表法分为正常对照组(n=7)、模型对照组(n=39)、PD98059(MEK1抑制剂)组(n=16)和LY294002(PI3K抑制剂)组(n=16),PD98059组和LY294002组大鼠分别于光凝后1d、7d玻璃体内注射5 mmol/L PD98059 3μl或5 mmol/L LY294002 3μl.分别于光凝前和光凝后1、3、7、14 d用过量麻醉法处死动物并制备样本和切片,采用Western blot法检测各组大鼠眼杯中ERK、p-ERK、Akt和p-Akt蛋白的表达变化,采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测各组大鼠眼杯中DDR2 mRNA和MMP-13 mRNA的表达变化,采用组织病理学方法测定各组大鼠CNV厚度,采用免疫组织化学和免疫荧光染色法分别定位和测定大鼠CNV区域DDR2和MMP-13的表达.结果 光凝后3d,光凝局部细胞增生,光凝后7 d CNV形成,至光凝后14 d CNV趋于稳定.免疫组织化学染色结果显示,DDR2在正常大鼠视网膜血管内皮细胞层、视网膜神经节细胞(RGCs)层和内核层细胞中呈弱表达,但在CNV中呈强阳性表达;MMP-13在正常对照组大鼠视网膜内界膜层、光感受器层和巩膜层均呈强阳性表达,在模型对照组中呈强阳性表达.免疫荧光结果显示,CNV组织中DDR2和MMP-13共表达.RT-PCR结果显示,模型对照组光凝后1、3、7、14 d DDR2 mRNA相对表达水平分别为55.22±4.03、47.74±2.23、14.82±4.56和5.59±2.47,MMP-13 mRNA相对表达水平分别为25.54±3.83、43.51±4.36、10.90±4.00和5.23±3.23,与正常对照组相比,差异均有统计学意义(均P＜0.05).免疫荧光结果显示,模型对照组光凝后3、7、14 d大鼠CNV区DDR2相对荧光密度单位(RFU)值分别为2.73±0.53、5.21±0.31和3.22±0.33,MMP-13 RFU值分别为1.66±0.17、3.57±0.44和2.67±0.21,组间总体比较差异均有统计学意义(F=81.01,P＜0.05;F=40.31,P＜0.01);PD98059组和LY294002组光凝后14 d CNV区DDR2 RFU值分别为1.14±0.19和1.03±0.14,与模型对照组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05),MMP-13RFU值分别为1.37±0.25和1.24±0.20,与模型对照组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).Western blot结果显示,模型对照组光凝后7d眼杯中p-ERK和p-Akt水平升高,与正常对照组大鼠相比差异均有统计学意义(均P＜0.05);至光凝后14 d恢复至近正常水平,与正常对照组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).PD98058组大鼠眼杯p-ERK水平明显下降,注射后7d、14 d PD98058组大鼠眼杯中p-ERK表达的抑制率分别为71.58％和65.21％,PD98058组7d与模型对照组7d比较、PD98058组14 d与模型对照组14 d比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).LY294002组大鼠眼杯中p-Akt表达水平明显下降,LY294002注射后7d、14d大鼠眼杯中p-Akt表达的抑制率分别为65.62％和67.04％,LY294002组7d与模型对照组7d比较、LY294002组14d与模型对照组14 d比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).各组眼杯中ERK和Akt的表达水平总体比较差异均无统计学意义(F=0.62,P＞0.05;F=0.81,P＞0.05).模型对照组、PD98059组和LY294002组光凝后14 d大鼠CNV厚度分别为(119.19±18.03)、(51.00±11.29)和(59.18±9.00) μm,总体比较差异有统计学意义(F=29.376,P＜0.05),与模型对照组比较,PD98059和LY294002注射后CNV厚度分别减少57.21％和50.34％,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 DDR2和MMP-13在大鼠CNV中表达上调,参与CNV的形成;MEK/ERK和PI3K/Akt通路通过参与调控DDR2和MMP-13在CNV局部的表达而抑制CNV的发生和进展.
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细胞间黏附分子-1在氪激光诱发的大鼠脉络膜新生血管中的动态表达变化
背景 细胞外基质(ECM)的种类繁多,具有重要的生物学功能,它在脉络膜新生血管(CNV)生长过程中的重要作用日益受到人们的关注,细胞间黏附分子-1(ICAM-1)就是其中之一.ICAM-1参与新生血管的生成,但目前CNV与ICAM-1相关性研究仍较少. 目的 观察ICAM-1在激光诱导的大鼠脉络膜新生血管(CNV)中的动态表达变化,探讨其在CNV形成过程中的作用,为CNV的靶向治疗提供依据.方法 按照随机数字表法将48只健康雄性清洁级BN大鼠随机分为光凝后1、2、3、4、5、6、7和8周组,每组6只,每只大鼠任意选取一眼作为实验眼,另一眼作为正常对照.采用氪激光光凝法建立CNV大鼠模型,每组大鼠实验眼于光凝后相应时间点行荧光素眼底血管造影(FFA)检查,计算荧光素渗漏量(吸光度,A值),检查后各组摘取眼球制备球壁石蜡切片,采用苏木精-伊红染色法检测大鼠CNV面积;分别采用免疫组织化学法和原位杂交技术测定大鼠CNV中ICAM-1蛋白及其mRNA的表达,并计算其相对表达量(A值). 结果 苏木精-伊红染色结果显示激光光凝后视网膜内外颗粒层连续性断裂并内陷,Bruch膜断裂,巨噬细胞迁移至光凝斑区,可见纤维母细胞及血管内皮细胞增生.免疫组织化学染色结果显示ICAM-1蛋白主要表达于血管内皮细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞和巨噬细胞中.原位杂交染色结果显示ICAM-1 mRNA主要表达于视网膜外颗粒层细胞中.视网膜光凝后不同时间组间CNV面积、荧光素渗漏量、ICAM-1蛋白及其mRNA相对表达量的总体比较差异均有统计学意义(F=194.43、178.84、739.08、2 463.51,均P＜0.05).随着光凝后时间的延长,大鼠CNV面积逐渐增加,荧光素渗漏量增多,ICAM-1蛋白及其mRNA相对表达量均呈逐渐增长的趋势,均于光凝后8周达到高水平.结论 大鼠CNV区ICAM-1的表达量随在光凝后时间的延长而升高,其表达趋势与CNV面积和荧光素渗漏程度相吻合.ICAM-1可能在CNV的发生和发展过程中起重要作用.
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BN大鼠β乳球蛋白过敏模型的建立
目的 利用BN大鼠建立β乳球蛋白致敏的动物模型.方法 采用连续灌胃及腹腔注射致敏蛋白的方式致敏BN大鼠,ELISA测定β乳球蛋白特异性IgE水平.口服给予β乳球蛋白激发过敏反应,苏木素-伊红及甲苯胺蓝染色观察肠粘膜组织病理变化,计数肠浸润肥大细胞数及肥大细胞脱颗粒比例.结果 模型组血清特异性IgE水平升高,β乳球蛋白激发后引起肠道炎症反应,肠粘膜肥大细胞浸润增加及肥大细胞脱颗粒比例增加.结论 本实验建立的的BN大鼠模型是较理想的食物过敏模型.
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杞黄颗粒对实验性脉络膜新生血管中HIF-1蛋白含量及基因表达的干预研究
目的:通过缺氧诱导因子 (HIF-1) 蛋白含量及基因的表达探讨杞黄颗粒对脉络膜新生血管 (CNV) 发生发展过程的作用机制.方法:健康雄性BN大鼠81只, 随机选取13只作为空白对照组, 另68只右眼通过激光光凝方式建立CNV模型.光凝7d后随机选取3只检验造模是否成功, 余下65只随机分为5组:模型对照组、杞黄颗粒A组、杞黄颗粒B组、雷珠单抗组、杞黄颗粒+雷珠单抗组, 各13只.治疗结束后, 除杞黄颗粒B组在治疗的第90天处死, 其余组大鼠均在治疗的第60天心脏灌注处死, 取右眼制作标本, 采用Western-blotting和RT-PCR检测HIF-1的蛋白含量及mRNA表达.结果:模型大鼠于激光后第7天OCT检查可见视网膜色素上皮复合层不连续, 局部增厚, 反射增强, 界限不清, 眼底荧光血管造影检查显示出少量圆盘状荧光渗漏, 表明造模成功.与空白对照组比较, 模型对照组HIF-1蛋白和其mRNA的表达趋势一致, 均有上调, 差异有统计学意义 (P＜0.05) .HIF-1蛋白表达量, 模型对照组明显高于杞黄颗粒+雷珠单抗组, 差异有统计学意义 (P＜0.01);杞黄颗粒A组、雷珠单抗组、模型对照组组间比较, 差异均无统计学意义 (P＞0.05);杞黄颗粒B组与A组比较, 差异有统计学意义 (P＜0.05) .HIF-1mRNA表达, 模型对照组明显高于雷珠单抗组、杞黄颗粒+雷珠单抗组, 杞黄颗粒A组表达高于雷珠单抗组和杞黄颗粒+雷珠单抗组, 差异均有统计学意义 (P＜0.05);杞黄颗粒+雷珠单抗组优于雷珠单抗组, 但差异无统计学意义 (P＞0.05);杞黄颗粒B组与A组比较, 差异有统计学意义 (P＜0.05) .结论:杞黄颗粒联合雷珠单抗在抑制CNV中下调HIF-1蛋白含量及基因表达效果较单纯应用杞黄颗粒更加稳定, 长期应用杞黄颗粒对抑制CNV有临床意义, 其作用机制可能与下调HIF-1因子有关.
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不同品系大鼠对灯盏花素过敏反应差异性研究
目的:比较研究F344、BN、SD、Wistar四种品系大鼠对灯盏花素注射液被动皮肤过敏及其致敏血清中总IgE水平差异性.方法:四种品系大鼠分别随机分为正常对照组、OVA组、灯盏花素组.采用皮下注射给予不同药物致敏,观察各组大鼠被动皮肤过敏反应(PCA)皮肤蓝斑直径大小和阳性率,并检测致敏血清总IgE水平.结果:PCA结果显示,四种品系大鼠的正常组均无蓝斑出现;OVA组,F344、BN、SD、Wistar大鼠蓝斑直径(阳性率)分别为11.67±3.61(6/6)、47.33±5.72(6/6)、5.70±4.81(6/10)、17.90±3.84(10/10),与正常组相比均明显升高且具有显著统计学差异；血清总IgE水平检测结果显示,OVA组血清总IgE含量变化与PCA试验结果一致.对灯盏花素,F344、BN、SD、Wistar大鼠蓝斑直径(阳性率)分别为5.17±2.32(4/6)、2.00±1.79(0/6)、1.67±1.97(0/10)、0.00±0.00(0/10),与正常组相比仅F344大鼠显示出显著性差异；血清总IgE仅F344、BN大鼠血清明显升高,且以F344大鼠变化倍数更高.结论:四种不同品系大鼠对灯盏花素所致被动皮肤过敏反应敏感性及血清总IgE水平均存在一定差异,两者具有一定相关性,其中以F344大鼠为敏感.
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大鼠视网膜细胞间隙连接蛋白Cx43的表达
目的:探讨细胞间隙连接蛋白connexin43(Cx43)在BN大鼠视网膜中的分布特点.方法:以雄性挪威棕色大鼠(Brown Norway)为研究对象,应用免疫组化方法观察Cx43在BN大鼠视网膜中的分布特点.结果:正常视网膜内界膜,视神经纤维层以及神经节细胞层明显表达,神经节细胞表达的主要位置是细胞质和细胞膜,色素上皮细胞全层表达,内外颗粒层及内外层状层无表达.结论:正常视网膜的Cx43主要分布在内界膜,神经纤维层,视网膜节细胞层和视网膜色素上皮层.
