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LLNA:BrdU-ELISA改良法在化学物/化妆品皮肤刺激性和致敏性评价中的应用
目的 探讨LLNA:BrdU-ELISA改良法在化学物/化妆品皮肤刺激性和致敏性评价中的应用.方法 8～10周龄雌性BALB/c小鼠随机分组(4只/组),将化学物,化妆品产品对小鼠双耳连续染毒3d,第5天腹腔注射标记液BrdU,第6天耳廓称重并分离颌下淋巴结制取细胞悬液,ELISA法测定细胞增殖.结果 α-己基肉桂醛(25％、50％)、柠檬醛(10％、25％、50％)、异丁香酚(10％、30％)氯仿(5％、50％、100％)、正己烷(100％)、3号粉底霜和5号烫发剂具有刺激性,其他组均无刺激性;丁子香酚(25％、50％)、α-己基肉桂醛(25％、50％)、异丁香酚(3％、10％、30％)、柠檬醛(10％、25％、50％)、氯仿(50％、l00％)、3号粉底霜和5号烫发剂为致敏阳性,其他组均为致敏阴性.结论 LLNA:BrdU-ELISA改良法应用BALB/c小鼠可较好地评价化妆品的皮肤刺激性和致敏性,并对化妆品中风险化学物苯、氯仿和正己烷的皮肤刺激性和致敏性进行了评估,完善了相关毒理数据.
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一种改进的局部淋巴结试验--噻唑蓝法
局部淋巴结试验(LLNA):小鼠耳后皮肤受致敏性化学物质刺激后,耳后淋巴结细胞可发生不同程度的增殖,据此来评价化学品是否具有致敏性及致敏强度.该试验周期短,所用动物数少.近年来,欧洲经济合作与发展组织(OECD),欧洲化学工业生态学与毒理学中心(ECETOC)等组织将它列入评价皮肤致敏物的首选方法.但现行的LLNA,应用受到一定限制,现用噻唑蓝(MTT)取代同位素来测定淋巴细胞增殖程度,探讨其在评价化学品致敏性中应用的可行性.
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应用于纺织品中的纳米铜皮肤刺激性和致敏性的研究
目的 分别使用3D皮肤模型和皮肤致敏性替代法及传统动物实验研究纳米铜的皮肤刺激性和致敏性.方法 采用EpiKutis 3D皮肤模型研究纳米铜的皮肤刺激性.皮肤致敏性替代法采用小鼠局部淋巴结试验:LLNA:BMU-ELISA方法和LLNA:DA方法研究纳米铜的致敏性;同时根据GB/T 21604-2008和GB/T 21608-208化学品皮肤刺激性和致敏试验方法研究纳米铜应用液的皮肤刺激性和致敏性.结果 3D皮肤模型皮肤刺激性试验结果表明1％纳米铜应用液(69 mg/L)和0.25％纳米铜应用液(17.2 mg/L) ET50值均大于24 h,两者均无刺激性.纳米铜应用液(6.9 g/L)的ET50值为14.86 h(ET50值为12 ～24 h之间),刺激性属于非常温和.LLNA:BrdU试验结果表明:纳米铜组小鼠耳肿胀、耳重、淋巴结重量和BrdU标记指数与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05),表明纳米铜应用液刺激性为阴性.SI值为1.3＜1.6,为致敏性阴性.LLNA:DA试验结果表明:纳米铜组小鼠耳肿胀、耳重、淋巴结重量和ATP发光值与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05),表明纳米铜应用液刺激性为阴性.SI值为1.3＜1.8,致敏性阴性.传统家兔皮肤刺激性和致敏性试验结果表明,6.9 g/L纳米铜应用液无刺激性.结论 3D皮肤模型皮肤刺激性试验和皮肤致敏性替代法与传统皮肤刺激性和致敏试验结果一致,可对本试验中纳米材料刺激性和致敏性做出较好评价.
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化妆品安全性评价中小鼠局部淋巴结试验方法的改进
目的 改进小鼠局邵淋巴结买验(LLNA),建立既可检测化学物致敏性也可同时检测刺激性的LLNA替代方法.方法 选取一种阴性物质:4-氨苯甲酸;三种致敏阳性物:2,4-二硝基氯苯(DNCB)、己基肉桂醛(HCA)和2-氨基酚(2-APC);以及两种刺激阳性物:氢氧化钾(KOH)、十二烷基硫酸钠(SIS).按常规LLNA方法对雌性Balb/c小鼠进行染毒,测量小鼠耳缘厚度并称量耳廓重量,于第6天获取耳引流淋巴结进行称重,制备单细胞悬液计数并用CCK-8试剂盒检测淋巴细胞增殖活性.结果 受试剂量氢氧化钾、十二烷基硫酸钠和2,4-二硝基氯苯在0.5%以上剂量,可引起耳缘厚度和耳廓重量增加,与对照组相比差异有显著性(P<0.05),可判定为对皮肤有刺激性,2.氨基酚和己基肉桂醛均无刺激性.三种致敏物在致敏试验中均呈阳性,但三指标的敏感性略有不同.已基肉桂醛,2,4-二硝基氯苯,2.氨基酚均可引起淋巴结重量增加和淋巴细胞计数增加(P<0.05);中剂量以上组己基肉桂醛和2,4-二硝基氯苯和高剂量2-氨基酚的CCK-8检测均见淋巴细胞增殖明显.结论 以耳缘厚度和耳廓重量作为刺激性观察指标,以淋巴结重量和淋巴细胞增殖作为致敏性观察指标的改良小鼠淋巴结实验可有效地同时评价化学物的皮肤致敏性和刺激性.
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流式细胞术在小鼠局部淋巴结试验中的应用研究
目的 将流式细胞术应用到小鼠局部淋巴结实验(local lymph node assay,LLNA)中,期望建立既可检测化学物致敏性也可同时检测刺激性的方法.方法 受试物分为溶剂对照[AOO(丙酮∶橄榄油=4∶1)]、阴性对照(NaCl)、致敏阳性物[己基肉桂醛(HCA)、2,4二硝基氯苯(DNCB)、2-氨基酚(2-APC)]、刺激阳性物[KOH、十二烷基硫酸钠(SLS)].采用8～10周龄16～22 g的雌性Balb/c小鼠76只,随机分为19个受试物剂量组,每剂量组4只小鼠.每种受试物分别设低、中、高3个剂量组,检测浓度分别为NaCl (100g/L、200 g/L、300 g/L)、HCA (V/V:3.3％、10.0％、30.0％)、DNCB (2.5 g/L、5.0 g/L、10.0g/L)、2-APC (12.5g/L、25.0g/L、50.0 g/L)、KOH (25 g/L、50 g/L、100 g/L)、SLS(50 g/L、100 g/L、200 g/L).于试验第1、2、3天将配制后不同浓度受试物稀释液以每耳25 μl/d均匀涂布于小鼠双侧耳后.检测小鼠耳缘厚度、耳引流淋巴结重量、B220+ (CD45R)亚群淋巴细胞百分数等指标.采用SPSS 11.5分析软件,对数据型指标进行方差分析,并对有差异的个体再行LSD两两比较,并根据刺激指数对受试物致敏性大小进行分级.结果 与溶剂对照比较中高剂量的SLS和KOH均可引起小鼠耳缘厚度增加(P＜0.01).可判定SLS、KOH对皮肤有刺激性.DNCB、HCA各剂量组和2-APC高剂量组刺激指数均大于3,可以判断该3种化学物为皮肤致敏物.根据SI计算EC3的值,对致敏物进行分类:DNCB (0.196)为强致敏物,HCA (1.556)和2-APC (3.156)为中等致敏物.结论 应用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测B220+ (CD45R)亚群淋巴细胞百分数作为致敏性观察指标的改良小鼠淋巴结实验,结合耳缘厚度检测可实现同时评价化学物的皮肤致敏性和刺激性.
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腘窝淋巴结试验模型的构建及在清开灵注射液致敏性研究中的应用
目的 构建直接和间接腘窝淋巴结试验(d-PLNA和s-PLNA)模型,并用其检测清开灵注射液(QKLI)的致敏性.方法 雌性BALB/c小鼠右侧后肢足趾一次性分别sc给予50μl盐酸D-青霉胺(D-Pen) 12.5,25.0,37.5,50.0和62.5 mg· kg-1,分别在给药后的第5,7和9天处死小鼠,摘取两侧腘窝淋巴结(PLN),计算PLN质量指数(MI)和细胞指数(CI),确定D-Pen的低有效剂量和佳解剖时间.小鼠右侧后肢足趾一次性sc给予D-Pen 37.5 mg·kg-1、QKLI原液、2倍和4倍QKLI原液,7d后活杀,进行d-PLNA实验.小鼠右侧后肢足趾一次性sc给予D-Pen和QKLI,2个月后,给予亚剂量激发,7d后活杀进行s-PLNA实验,检测MI和CI.结果 根据MI≥2和CI≥5阳性标准判定D-Pen低有效剂量为37.5 mg·kg-1,佳解剖时间为给药后第7天.d-PLNA实验结果显示,QKLI原液组处理侧PLN的质量和细胞计数较未处理侧有轻度的升高,但未达到阳性反应判定标准；2倍原液浓度组MI为2.0±1.0,CI为5.4±0.9;4倍原液浓度组MI为3.4±0.4,CI为5.4±0.9,均达到阳性反应判定标准.s-PLNA实验结果显示,2倍原液浓度组MI为2.4±0.6,CI为6.2±0.8;4倍原液浓度组MI为3.2±0.9,CI为8.4±1.8均达到阳性反应判定标准.结论 制备了能够用于致敏实验的腘窝淋巴结模型,利用此模型发现QKLI具有诱发过敏反应的可能.
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腘窝淋巴结试验在药物超敏反应研究中的应用
免疫介导药物超敏反应(IDHR)是一种常见、也为复杂的药物不良反应.迄今为止,尚无可靠的动物模型可以有效预测IDHR.已有研究发现,腘窝淋巴结试验(PLNA)操作简单,省时,灵敏,特异性高,可靠性和重复性好,实验动物用量少.尽管其反应机制不清,给药途径为非常规途径,缺乏公认的评价标准,剂量水平、溶媒种类及实验周期的选择等各不一致,但PLNA是一种有希望可成功预测IDHR的动物模型方法.本文综述了PLNA的原理、分类和应用,并分析了PLNA在成分复杂的中药超敏反应研究方面的应用前景.
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LLNA：BrdU-ELISA 改良法的建立及其在化妆品安全性评价中的应用
目的：建立可快速检测化学物致敏性和刺激性的局部淋巴结试验（ LLNA：BrdU-ELISA）改良法，并对化妆品产品进行评价。方法3种化学物（2，4二硝基氯苯（ DNCB）、丁子香酚、己基肉桂醛）和3种化妆品产品作为受试物，雌性BALB／c小鼠连续染毒3天，测量小鼠耳缘厚度，第5天腹腔注射BrdU，第6天称耳廓重，分离颌下淋巴结称重并制取单细胞悬液，用ELISA试剂盒检测淋巴细胞增殖。结果 DNCB（1.0％）、己基肉桂醛（25％、50％）和3号粉底霜引起耳肿胀和耳廓重显著增加（P ＜0.05或P ＜0.01），可能为刺激物，其他均无刺激性；3种化学物和3号粉底霜致敏检测阳性，其他均为阴性。结论结合小鼠耳肿胀和耳廓重的LLNA：BrdU-ELISA改良法可较好地评价化学物和化妆品产品的致敏性和刺激性，有望在化妆品安全性评价中发挥重要作用。
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两品系小鼠局部淋巴结试验结果比较
目的：分析比较 BALB／c 和 CBA 小鼠局部淋巴结试验结果。方法将已知致敏性的4种化学物（2，4－二硝基氯苯、丁子香酚、己基肉桂醛和异丙醇）和未知致敏性的3种化妆品对 BALB／c 和 CBA 小鼠连续染毒3 d，第5天腹腔注射示踪剂 BrdU，第6天分离颌下淋巴结制取单细胞悬液，用 ELISA 试盒检测细胞增殖。结果2，4－二硝基氯苯、丁子香酚、己基肉桂醛和3号烫发剂两品系结果均呈致敏阳性，3种化学物 EC1．6值分别为0．08％（极强）、4．02％（中）、6．68％（中）（BALB／c）和0．07％（极强）、6．08％（中）、8．89％（中）（CBA）；异丙醇、1和2号化妆品两品系结果均为致敏阴性，SI 均小于1．6。结论两品系小鼠局部淋巴结试验结果较一致，BALB／c可替代 CBA 小鼠应用于化学物和化妆品的致敏性评价。
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BALB/c小鼠LLNA∶BrdU-ELISA改良法在15种化学物皮肤致敏性评价中的应用
目的 探讨BALB/c小鼠BrdU-ELISA改良法在化学物皮肤致敏性评价中的应用.方法 采用BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA改良法,对13种已知和2种未知致敏性化学物进行评价,并进行方法真实性分析.结果 香叶醇(25％)、丁子香酚(25％)、异丁香酚(25％)、反式肉桂醛(20％)、α-己基肉桂醛(25％)、水杨酸己酯(5％)、对苯二酚(5％)、2,4-二硝基氯苯(0.3％)、苯(100％)、氯仿(100％)为致敏阳性,其余5种均为致敏阴性;方法真实性分析显示,该法阳性预测率为90％、阴性预测率为100％、假阳性率为17％、假阴性率为0、灵敏度为100％、特异度为83％、准确度为93％.结论 BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA改良法可较好地评估化学物的致敏性,并完善了香叶醇、水杨酸己酯致敏性的相关毒理数据.
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BALB/c小鼠LLNA∶DA改良法在15种化学物皮肤致敏性评价中的应用
目的 探讨BALB/c小鼠LLNA∶DA改良法在化学物皮肤致敏性评价中的应用.方法 采用BALB/c小鼠LLNA∶DA改良法,对13种已知和2种未知致敏性化学物进行评价,并进行方法真实性分析.结果 25％香叶醇、25％丁子香酚、25％异丁香酚、20％反式肉桂醛、25％α-己基肉桂醛、5％水杨酸己酯、5％对苯二酚、0.3％2,4-二硝基氯苯、100％苯、100％氯仿、25％水杨酸为致敏阳性,其余4种均为致敏阴性;方法真实性分析显示,该法阳性预测率为82％、阴性预测率为100％、假阳性率为33％、假阴性率为0、灵敏度为100％、特异度为67％、准确度为87％.结论 BALB/e小鼠LLNA:DA改良法可较好地评估化学物的致敏性,并完善了香叶醇、水杨酸己酯致敏性的相关毒理数据.
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小鼠局部淋巴结检测结合耳肿胀程度鉴别光敏物的评估
目的建立小鼠局部淋巴结检测结合耳肿胀程度评估的方法鉴别光敏物.方法受试物加UVA照射(剂量10 J/cm2)连续3 d在BALB/c小鼠耳背部进行激发,后一次照射结束后24 h切取引流的局部淋巴结,用淋巴细胞计数和MTT比色法测定淋巴细胞增殖率反映局部淋巴结的增殖情况:同时测量小鼠耳肿度以反映皮肤的刺激反应;用双抗体夹心ELISA法进一步测定局部淋巴结细胞72 h培养上清液中干扰素-γ(IFN-γ),白介素-2(IL-2)以及白介素-4(IL-4)的含量.结果强光变应原四氯水杨酰苯胺引起局部淋巴结的增殖反应而不伴耳肿胀反应;弱光变应原6甲基香豆素既不引起局部淋巴结的增殖反应又不出现耳肿胀反应;光毒物质8-甲氧补骨脂素同时引起局部淋巴结增殖和耳肿胀反应.用四氯水杨酰苯胺预先致敏后再进行激发,局部淋巴结中IL-4的分泌量明显升高(P＜0.05).结论小鼠局部淋巴结检测结合耳肿胀程度评价的方法可较快鉴定较强的接触性光变应原和光毒物质,但对识别较弱的光变应原敏感性不足;预先致敏后激发阶段局部淋巴结中IL-4的分泌量明显升高是光变应原区别于光毒物质的突出特点.
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溴脱氧尿嘧啶核苷掺入法作为皮肤致敏试验替代方法研究
目的 探讨应用溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)示踪和酶联免疫吸附测定(ELISA)的局部淋巴结试验(LLNA:Br-dU-ELISA法)替代LLNA(放射法)作为皮肤变态反应试验替代方法的可行性.方法 雌性BALB/c小鼠随机分组,每组4只.选择27种受试物进行测试,每种受试物视情况设3～4个剂量组和1个溶剂时照组.将受试物连续3d涂抹于小鼠双耳背,第5天腹腔注射BrdU标记液,第6天摘取小鼠耳部淋巴结,制备淋巴细胞悬液,采用ELISA技术测定BrdU掺入细胞的水平.选择3种受试物进行3次重复性试验以了解结果的重现性;将27种受试物的LLNA:BrdU-ELISA法与文献报告的LLNA(放射法)结果比较,分析方法的致敏性判别能力及分级结果的一致性和相关性.结果 LLNA:Br-dU-ELISA法结果重现性较好(F=2.890,P＞0.05);与LLNA(放射法)相比,该方法对27种化学物的致敏性判别能力较好(灵敏度= 95.00%,特异度=85.71%,符合率=92.59%),致敏性分级结果有较好的一致性和相关性(Kappa=0.575,Gamma=0.959).结论 LLNA:BrdU-ELISA法可作为皮肤变态反应试验的替代方法应用于化学物皮肤致敏性评价.
