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人脐带间充质干细胞联合番茄红素延缓比格犬的自然衰老
背景：实验室前期已初步表明干细胞联合番茄红素对D-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老作用显著，且能明显改变衰老机体的免疫功能。
目的：观察人脐带间充质干细胞联合番茄红素对自然衰老比格犬的抗衰老作用。
方法：选用自然衰老的健康比格犬(6至7岁龄)16只，随机分为衰老对照组和衰老治疗组，以健康青年犬(3至4岁龄)作为青年对照组。衰老治疗组给予人脐带间充质干细胞和番茄红素联合治疗，其余两组给予等量的DMEM/F12细胞培养液和等量葵花籽油。治疗过程中定期观察各组犬的一般状况，测定血清中超氧化物歧化酶活性、丙二醛浓度及谷胱甘肽过氧化物酶活性。治疗24周后处死全部动物，观察各器官组织结构的病理变化。
结果与结论：①治疗前，衰老对照组和衰老治疗组血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性均低于青年对照组，血清丙二醛浓度均高于青年对照组，差异有显著性意义(P均<0.05)，而衰老对照组和衰老治疗组之间差异无显著性意义(P >0.05)。②衰老治疗组经24周治疗后，比格犬皮毛明显光滑，活动力加强，食欲较好；与治疗前和衰老对照组比较，血清中超氧化物歧化酶活性从治疗第8周起显著升高，谷胱甘肽过氧化物酶活性从第6周起显著升高(P均<0.05)，血清丙二醛浓度从治疗第4周起显著降低(P均<0.05)。③实验结束后，与衰老对照组比较，衰老治疗组各组织器官结构清晰，基本无炎性浸润，无明显坏死及纤维化病变，与青年对照组组织器官表现基本一致。以上结果表明脐带间充质干细胞联合番茄红素治疗能不同程度提高自然衰老比格犬血清抗氧化物酶的活性，降低丙二醛浓度，且能促进修复改善组织器官结构及功能，故具有明显的抗衰老作用。 -
氯化钴模拟低氧环境下人脐带间充质干细胞增殖及基因蛋白的表达
背景：氯化钴可促进人脐带源性间充质干细胞的增殖，具有时间和浓度依赖性，并对其基因蛋白表达具有调控作用。目的：研究氯化钴模拟的低氧环境对人脐带源性间充质干细胞的增殖及基因蛋白表达的影响，旨在建立高效的间充质干细胞体外培养扩增体系。方法：采用组织块法提取人脐带间充质干细胞，氯化钴模拟化学低氧环境，在不同浓度(0，100，150，200，250μmol/L)和不同时间(0，1，2，3，4 d)条件下，用流式细胞仪进行细胞表面相关抗原的鉴定及细胞周期检测；CCK-8法测定细胞增殖情况；RT-PCR测定缺氧诱导因子1α、诱导型一氧化氮合酶、基质细胞衍生因子1、白细胞介素6、转化生长因子β mRNA的表达；Western blot测定缺氧诱导因子1α蛋白的表达。结果与结论：人脐带间充质干细胞表面相关抗原CD29、CD73、CD90、CD105表达阳性，CD31、CD14、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR呈阴性表达，且不受氯化钴模拟的低氧环境影响。氯化钴模拟的化学性低氧可促进人脐带间充质干细胞增殖，且具有一定时间及浓度依赖性。RT-PCR检测到低氧组缺氧诱导因子1α、诱导型一氧化氮合酶、基质细胞衍生因子1 mRNA表达上调，而白细胞介素6及转化生长因子β mRNA表达下调，差异有显著性意义(P <0.05)。低氧组中缺氧诱导因子1α蛋白表达增高。结果表明氯化钴模拟的体外低氧环境能促进人脐带间充质干细胞增殖，佳浓度为200μmol/L，但过高浓度(250μmol/L)时反而抑制其增殖，机制可能与缺氧诱导因子1α基因与蛋白表达增加相关。
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Notch信号通路阻断剂对人脐带间充质干细胞软骨分化的影响
背景：Notch 信号通路作为一条在细胞增殖和分化过程中起重要作用的信号通路，目前它在人脐带间充质干细胞在体外向软骨细胞诱导分化过程中的作用仍然未知。目的：首次探讨 Notch 信号通路特异性阻断剂2，4-二氨基-5-苯噻唑(DAPT)对人脐带间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的影响。方法：从人脐带中分离获得间充质干细胞，体外向软骨细胞诱导分化。实验分4组：①无诱导组换成含体积分数5%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基培养。②单纯诱导组换成终浓度为6.25 mg/L胰岛素、6.25 mg/L转铁蛋白、10μg/L转化生长因子β1、0.1μmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C、体积分数5%胎牛血清和1%双抗的软骨诱导培养基培养。③二甲基亚砜组在软骨诱导培养基中加入终浓度为0.1%的二甲基亚砜培养。④2，4-二氨基-5-苯噻唑组在软骨诱导培养基中加入终浓度为5μmol/L的2，4-二氨基-5-苯噻唑(溶于二甲基亚砜)培养，二甲基亚砜终浓度为0.1%。结果与结论：诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化后，细胞形态由长梭形变为多边形，且甲苯胺蓝染色和免疫荧光染色均呈现阳性；软骨诱导分化后Jag-1、PS-1、Notch-1、Hes-1的基因表达均明显下降(P<0.01)；添加2，4-二氨基-5-苯噻唑后，与单纯诱导组相比，人脐带间充质干细胞中Jag-1、PS-1、Hes-1(P<0.01)和Notch-1(P<0.05)的基因表达显著降低；蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白含量均降低(P<0.01)；蛋白聚糖的基因表达显著降低(P<0.01)，Ⅱ型胶原蛋白的基因表达也出现一定程度的下降。提示Notch信号存在于人脐带间充质干细胞中，诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化后，这种信号强度迅速减弱；2，4-二氨基-5-苯噻唑可能通过Jag-1-Notch-1-Hes-1途径抑制人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化。
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原代人脐带间充质干细胞培养方法的研究
背景：如何获得大量稳定活力好的细胞是人脐带间充质干细胞培养的难点。
目的：通过组织块法、酶消化法和酶解组织块法3种细胞培养方法比较，筛选出佳的人脐带间充质干细胞的培养方式。
方法：分离新鲜脐带10根，分别采用组织块法、酶消化法、酶解组织块法3种方式培养人脐带间充质干细胞，比较3种方式原代人脐带间充质干细胞爬出所需时间、细胞培养成功率、绘制细胞增殖曲线，利用流式细胞仪检测细胞表面标志，并进行多项分化能力检测。
结果与结论：酶解组织块培养法原代人脐带间充质干细胞爬出所需时间与酶消化法无显著差异，但明显短于组织块法(P <0.01)，原代人脐带间充质干细胞培养成功率显著高于其他两组，人脐带间充质干细胞增殖情况3组无显著性差异，酶解组织块培养法培养的第3代人脐带间充质干细胞其细胞表面标志及多项分化能力符合间充质干细胞的特性。酶解组织块培养法能缩短原代人脐带间充质干细胞爬出时间，显著提高原代人脐带间充质干细胞的成功率。 -
人脐带间充质干细胞联合番茄红素对衰老小鼠免疫功能的影响
背景:人脐带间充质干细胞、番茄红素均有延缓衰老的作用,而二者联合应用对衰老机体免疫功能影响的研究却未见报道.目的:分析人脐带间充质干细胞联合番茄红素对D-半乳糖诱导衰老小鼠免疫功能的影响.方法:ICR小鼠雌雄各半,随机分为正常对照组、模型组、番茄红素组、干细胞组及干细胞联合番茄红素组.模型组与各治疗组连续8周颈背部皮下注射D半乳糖溶液,同时进行相应的治疗干预.造模结束后检测各组小鼠血液衰老相关T淋巴细胞百分比、血清白细胞介素2、白细胞介素4水平并观察脾脏、胸腺组织结构.结果与结论:3个治疗组均能提高衰老小鼠血液CD3+、CD8+CD28+T细胞百分比及血清白细胞介素2、白细胞介素4水平(P＜0.01);与模型组相比,联合组初始性CD8+T细胞百分比升高,记忆性CD8+T细胞百分比降低(P＜0.05),干细胞及番茄红素组初始性及记忆性CD8+T细胞百分比变化不显著(P＞0.05);各组初始性及记忆性CD4+T细胞百分比变化均不显著(P＞0.05);胸腺、脾脏镜下观察发现:模型组胸腺小体缩小,脾脏淋巴小结明显增多,髓质淤血;正常对照组与3个治疗组胸腺、脾脏皮质髓质均未见明显病变.结果表明人脐带间充质干细胞、番茄红素均可以不同程度改善衰老小鼠免疫功能,且联合治疗效果更优.
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荧光定量PCR检测恶性转化人脐带间充质干细胞中DNA甲基化转移酶的改变
背景:根据体外培养的成体干细胞自发恶性转化现象及肿瘤干细胞理论,人脐带间充质干细胞在体外培养过程中可能产生变异,体内移植后可能存在致瘤性风险.因此,建立健全的体外安全性检测程序,将在干细胞临床应用上起积极推动作用.目的:探讨人脐带间充质干细胞致瘤性机制及DNA甲基化转移酶的表达水平.方法:采用组织块贴壁法分离、培养、扩增出人脐带间充质干细胞,利用3-甲基胆蒽促使人脐带间充质干细胞发生恶性转化,通过形态学观察,裸鼠成瘤实验进行验证,成瘤组织进行病理学鉴定、原代细胞培养,荧光定量PCR检测人脐带间充质干细胞与肿瘤细胞DNA甲基化转移酶表达水平的差异.结果与结论:①人脐带间充质干细胞经3-甲基胆蒽处理后形成恶性转化细胞,呈恶性生长,细胞核型呈非整数倍体改变,注入裸鼠体内后能形成恶性肿物;②经荧光定量PCR检测,恶性转化后肿瘤细胞(实验组)相比二甲基亚砜培养人脐带间充质干细胞(对照组),其DNA甲基化转移酶的基因表达量明显增高;③结果表明,人脐带间充质干细胞在一定条件下能发生恶性转化,包括形态学变化及表观遗传学层面改变,DNA甲基化转移酶可作为预防干细胞移植后成瘤的进一步研究方向.
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两种肝组织匀浆上清液诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的比较
背景:前期研究证明正常大鼠肝组织匀浆上清液可诱导人脐带间充质干细胞定向分化为具有部分肝细胞功能的肝样细胞,而肝纤维化大鼠肝组织匀浆上清液的诱导可行性及与前者诱导效果的比较尚不明确.目的:比较正常肝组织及纤维化肝组织微环境诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的能力.方法:采用腹腔注射3%硫代乙酰胺生理盐水溶液(200 mg/kg,2次/周,共4周)的方法制备SD大鼠肝纤维化模型,取肝纤维化大鼠及正常大鼠肝脏制备肝组织匀浆上清.将第 3 代人脐带间充质干细胞进行分组诱导培养:①标准对照组:加入含体积分数为 10%胎牛血清的 DMEM/F12 培养基.②纤维化肝组织匀浆组:加入含体积分数为10%胎牛血清及50 g/L纤维化肝组织匀浆的DMEM/F12培养基.③正常肝组织匀浆组:加入含体积分数为10%胎牛血清及100 g/L正常肝组织匀浆的DMEM/F12培养基.诱导开始后于倒置显微镜下观察各组细胞形态学变化;取标准对照组及诱导7 d的匀浆组细胞采用Western Blot法检测CK18、AFP、CYP3A4、CYP2E1、CYP2D6、TPH2的表达情况,采用ELISA法测定各组细胞培养液中白蛋白水平.结果与结论:与标准对照组长梭形成纤维样细胞相比,诱导7 d时,肝纤维化匀浆组及正常匀浆组细胞形态变化明显,呈类圆形,胞体丰满.与标准对照组相比,两匀浆组细胞均可表达肝细胞标志物CK18和AFP.标准对照组细胞可表达少量CYP2E1,两匀浆组细胞表达CYP3A4、CYP2E1、CYP2D6、TPH2等肝细胞功能蛋白,且CYP2E1的表达量较标准对照组明显增加(P < 0.01),而两匀浆组间上述蛋白的相对表达量差异无显著性意义(P > 0.05).同时,两匀浆组细胞分泌白蛋白的能力较标准对照组亦明显增强(P < 0.01),两匀浆组相比差异无显著性意义(P > 0.05).实验结果显示正常肝组织和纤维化肝组织微环境均可诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化,在达到相同诱导效果时,纤维化肝组织所需组织液浓度更低,提示纤维化肝组织微环境可能更有利于人脐带间充质干细胞向肝细胞分化.
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混合人AB血清体外有效扩增脐带间充质干细胞的可行性
背景:目前人脐带间充质干细胞培养多采用体积分数为10％胎牛血清或者多种细胞因子组合或者商品化的无血清间充质干细胞专用培养基进行培养,但还没有一种价格低廉、适用临床和相对安全用于患者的标准化培养体系.目的:探讨混合人AB血清用于培养人脐带间充质干细胞的可行性.方法:采用组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞,分别用含体积分数为10％人AB血清的基础培养基以及无血清间充质干细胞专用培养基进行培养,检测2种培养体系中人脐带间充质干细胞的细胞形态、免疫表型、细胞周期等基础指标.结果与结论:①2种培养体系中的人脐带间充质干细胞形态没有显著差异,均为长梭形,但混合人AB血清培养的人脐带间充质干细胞黏附力更强;②流式细胞检测结果显示,2种培养体系中人脐带间充质干细胞均高表达CD73和CD90,低表达CD45和HLA-DR,且表达量差异无显著性意义(P＞0.05);③细胞周期结果显示,2种培养体系中多数人脐带间充质干细胞处于G0-G1期以及S期,DNA指数、变异系数均在正常范围之内;④实验证实,混合人AB血清可作为临床级别的人源血清添加到基础培养基中安全使用.
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人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的免疫原性变化
背景:人脐带间充质干细胞具有低免疫原性,而人脐带间充质干细胞诱导分化的胰岛素分泌细胞是否保持低免疫原性尚不清楚.目的:探讨人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化后在体外的免疫原性变化及移植到宿主后微环境对免疫原性的影响.方法:①采用经典改良方案诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞,流式细胞术检测胰岛素分泌细胞免疫表型及细胞毒性实验中胰岛素分泌细胞的凋亡率;②CCK-8检测单向混合淋巴细胞实验中外周血单个核细胞的增殖能力;③小鼠腹腔及左肾包膜移植胰岛素分泌细胞后,流式细胞术及免疫组织化学检测移植部位的免疫细胞浸润情况.结果与结论:①人脐带间充质干细胞分化的胰岛素分泌细胞高表达 HLA-ABC,低表达 HLA-DR,CD40和CD80;②细胞毒性实验中胰岛素分泌细胞的凋亡率随预致敏脾细胞的增多而升高;③单向混合淋巴细胞实验中效靶比为10:1,50:1时胰岛素分泌细胞能抑制外周血单个核细胞增殖;④腹腔及左肾包膜移植胰岛素分泌细胞后移植部位淋巴细胞增多;⑤结果表明,人脐带间充质干细胞诱导分化的胰岛素分泌细胞在体外保持低免疫原性,但移植到体内后由于微环境的变化而具有一定免疫原性.
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人脐带间充质干细胞条件培养基脂质体修复大鼠皮肤创面损伤
背景:干细胞条件培养基中含有大量有助于伤口修复的细胞分泌因子,用脂质体包裹有助于细胞因子在伤口处的缓释作用.目的:研究人脐带间充质干细胞条件培养基脂质体对大鼠皮肤创面愈合的影响.方法:采用组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞并进行相关因子检测.取20只SD大鼠(购自山西医科大学实验动物中心)用于制备直径1 cm的皮肤创面模型.薄膜分散制备条件培养基脂质体囊泡用于大鼠皮肤缺损伤口,取修复部位皮肤及周围组织进行苏木精-伊红染色病理切片观察,通过组织学评分统计分析判断其对创伤的修复情况.结果与结论:①人脐带间充质干细胞表面标志物CD73、CD90、CD105阳性率分别为99.7％、95.7％、99.4％,CD45、CD34阳性率分别为1.1％、0.1％,且能诱导分化为骨细胞、脂肪细胞;②条件培养基中血管内皮生长因子、白细胞介素8、单核细胞趋化蛋白1的质量浓度分别为558.60 ng/L、5236.48 ng/L、2972.55 ng/L;③用薄膜分散法制备得到人脐带间充质干细胞条件培养基脂质体平均粒径为262.3 nm;④人脐带间充质干细胞条件培养及其脂质体均可促进大鼠皮肤缺损处的毛囊、腺体发生,且表皮层加厚,组织学评分显著升高,第2天的条件培养基与条件培养基脂质体差异无显著性意义(P=0.730),其他各组之间有显著差异(P＜0.05);⑤结果提示,人脐带间充质干细胞条件培养基及其脂质体可以促进大鼠缺损伤口的修复.
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人脐带间充质干细胞来源外泌体提取方法的比较
背景:近年来"无细胞"的干细胞治疗方法备受关注,但对于提取高质量外泌体的方法尚无确切定论.目的:采用3种方法提取人脐带间充质干细胞中的外泌体,筛选佳提取外泌体的方法.方法:分别用Total Exosome Isolation试剂盒、Exo Quick试剂盒及差速超速离心法提取人脐带间充质干细胞来源的外泌体.使用透射电镜观察外泌体形态,BCA法进行蛋白质定量,western blot检测外泌体表面标志物CD9、CD81、CD63的表达.结果与结论:①3种方法均可以从培养基中提取到间充质干细胞来源的外泌体,并且在透射电镜下观察到圆形或椭圆形的膜性小囊泡;②差速超速离心法提取的外泌体中的蛋白浓度和纯度高,Exo Quick 试剂盒法其次,Total Exosome Isolation试剂盒法得到的蛋白浓度低,且3者比较差异有显著性意义(P < 0.05);③3种方法提取的外泌体均表达其表面特异性标志物 CD81、CD63和CD9,且在含有相同蛋白浓度的情况下,差速超速离心法提取的外泌体的表面标志物含量高,Exo Quick 试剂盒法其次,Total Exosome Isolation试剂盒法提取的外泌体表面标志物含量较低;④差速超速离心法和Total Exosome Isolation试剂盒法的操作时间明显多于Exo Quick试剂盒法,差异有显著性意义(P < 0.05);⑤结果表明,尽管差速超速离心法耗时稍长,但是纯度相对较高,满足实验的基本需求,可作为一种合理的分离方法.
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直接共培养诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞的分化
背景:软骨细胞和间充质干细胞都可用于构建组织工程化软骨,但体外培养的软骨细胞容易发生去分化,表型难以维持,以致其临床应用受到限制.目的:探讨人脐带间充质干细胞与人关节软骨细胞直接共培养对人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化的影响,以及直接共培养的佳比例.方法:分离培养人脐带间充质干细胞并通过流式细胞仪鉴定表面标志.实验分为6组:直接共培养组按照人脐带间充质干细胞与人关节软骨细胞比例为1∶1,3∶1及5∶1(人脐带间充质干细胞:人关节软骨细胞)进行共培养;阳性对照组用转化生长因子β1细胞因子诱导;人关节软骨细胞空白对照组和人脐带间充质干细胞空白对照组.免疫荧光细胞化学检测Ⅱ型胶原(COL2A1)的表达水平;Western blot检测细胞SOX9Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原蛋白表达水平;实时荧光定量qRT-PCR检测SOX9、Col1a1、Col2a1 mRNA表达.结果与结论:①成功分离并鉴定人脐带间充质干细胞;②人脐带间充质干细胞与软骨细胞共培养28 d后,共培养组及单独药物诱导的阳性对照组Ⅱ型胶原免疫荧光检测均呈阳性;③阳性对照组的Col2a1 mRNA表达水平高于共培养组,但Ⅱ型胶原蛋白表达总量低于共培养组,1∶1共培养组的Col2a1 mRNA表达水平高于3∶1和5∶1共培养组.阳性对照组和共培养组的Col1a1 mRNA表达水平和Ⅰ型胶原蛋白表达水平均低于人关节软骨细胞空白对照组.④结果说明,人脐带间充质干细胞和人关节软骨细胞直接共培养可明显促进人脐带间充质干细胞向软骨样细胞诱导分化,并有效抑制细胞纤维化,从缩减软骨细胞用量方面看,直接共培养体系的适宜比例为5∶1.采用直接共培养诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的成本较低,是一种较为经济合理的诱导方法.
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人脐带间充质干细胞治疗乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的危险因素分析
背景:随着间充质干细胞治疗的不断发展,相关文献报道干细胞治疗可能会导致肿瘤的发生发展.目的:了解人脐带间充质干细胞移植治疗乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的潜在风险.方法:收集2011年1月至2013年12月在解放军第一○五医院感染病科住院治疗的乙型肝炎肝硬化患者,随访36个月,终点为确诊肝细胞癌.对可能影响肝细胞癌发生的相关危险因素进行单因素Logistic和多因素非条件Logistic回归分析.结果与结论:①386例患者完成随访,其中171例接受人脐带间充质干细胞治疗的患者为观察组,215例仅接受常规内科综合治疗的患者为对照组;②随访12个月时,观察组肝细胞癌的发病率明显高于对照组(P <0.05),随访36个月时,观察组肝细胞癌的发生率为11.7%,对照组为9.8%(P > 0.05);③单因素Logistic回归分析显示观察组和对照组内肝细胞癌患者在年龄、甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)、甲胎蛋白异质体比率(AFP-L3%)、高尔基体糖蛋白73(GP73)等方面均显著高于非肝细胞癌患者(P < 0.05),多因素非条件 Logistic 回归分析显示仅甲胎蛋白异质体比率是人脐带间充质干细胞治疗后乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的独立危险因素;④结果表明,人脐带间充质干细胞治疗不会导致乙型肝炎肝硬化患者3年内肝细胞癌总发病率的上升,但可能会引起肝细胞癌发病时间的提前;甲胎蛋白异质体比率可作为人脐带间充质干细胞治疗后乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的早期预测指标.
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人脐带间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化:两种方法的比较
背景:干细胞因其可向神经元样细胞诱导分化而在临床神经损伤疾病治疗中具有广阔的前景,但干细胞向神经元样细胞诱导分化的效率不高,为此作者对传统的诱导方法进行了改良.目的:探讨2种不同方法诱导人脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化的潜能及2种诱导方法的优劣.方法:采用组织块法分离培养人脐带间充质干细胞,显微镜下观察其形态并利用流式细胞仪进行干细胞鉴定,在神经营养因子诱导方案下,采用相同的诱导剂(2％B27、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子),2种不同的诱导方法将其向神经元样细胞诱导分化(传统方法:将B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及青链霉素合剂加入DMEM/F12培养基中进行诱导,3 d后加入全反式维甲酸,共培养10 d;改良方法:将B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、青链霉素合剂及胎牛血清加入DMEM/F12培养基中进行诱导,6 d后用胰酶消化后重新接种于共聚焦小皿内,次日去除B27和胎牛血清,并加入全反式维甲酸,共培养14 d).应用免疫荧光染色对诱导分化后细胞表面神经标志物——神经丝蛋白(NF-M)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)进行检测,比较2种方法诱导后细胞表面神经标志物的阳性表达率.结果与结论:①成功分离出人脐带间充质干细胞,经流式细胞仪鉴定其高表达CD29、CD105,低表达CD34、CD45,符合干细胞特性;②2种方法诱导后,镜下观察到的细胞均可呈现神经细胞样改变,免疫荧光检测提示2种方法诱导后细胞中神经丝蛋白与胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达;③传统方法组神经丝蛋白与胶质纤维酸性蛋白的阳性率分别为18.73％和18.01％,改良方法组二者的阳性率分别为27.48％和29.24％,两组比较差异有显著性意义(P<0.05);④结果表明,2种诱导方法均可将人脐带间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞;但在诱导分化后的细胞形态、神经标志物(神经丝蛋白与胶质纤维酸性蛋白)的阳性表达率方面,改良方法更具有优势.
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单唾液酸四己糖神经节苷脂佳质量浓度诱导人脐带间充质干细胞向神经元样细胞的分化
背景:国内外研究证实单唾液酸四己糖神经节苷脂在体外能够诱导人脐带间充质干细胞分化为神经元样细胞,但探索其合适的诱导剂量等相关研究甚少.目的:探索单唾液酸四己糖神经节苷脂在体外诱导人脐带间充质干细胞分化为神经元样细胞的佳质量浓度.方法:采用胶原酶消化法获取人脐带间充质干细胞,扩增后,取第3代细胞,随机分为5组,当细胞融合至70%-80%时,分别加入质量浓度为50,100,150,200 mg/L单唾液酸四己糖神经节苷脂的诱导液,空白对照组只加入等量L-DMEM培养基.倒置显微镜下观察细胞形态变化.诱导第6小时用免疫细胞化学染色方法检测GFAP、NF-H、MAP-2的表达.结果与结论:从脐带组织中分离出来的人脐带间充质干细胞可以稳定传代,并表达间充质干细胞表面标志,单唾液酸四己糖神经节苷脂可以诱导人脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化,并表达成熟神经细胞标志物MAP-2、NF-H,佳诱导质量浓度为150 mg/L.
关键词： 干细胞 单唾液酸四己糖神经节苷脂 人脐带间充质干细胞 诱导分化 神经元样细胞 -
长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性及其限制性
背景:间充质干细胞具有多向分化能力、免疫调节能力,并可在体外进行长期培养扩增,但其体外长期培养的生物学活性变化特点及其限制性仍不十分清晰.目的:观察体外长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性变化特点及其限制性.方法:无菌收集剖宫产新生儿脐带,经胶原酶Ⅱ消化后,用黏附生长选择法获取人脐带间充质干细胞,胰酶消化传代;取第3代细胞进行流式分析,脂肪和成骨诱导鉴定;收集不同代的细胞分别用MTT法、流式细胞仪和爬片分析法检测细胞增殖活性、细胞周期、凋亡率及黏附能力.结果与结论:人脐带间充质干细胞的细胞表型CD105+/CD29+/CD44+/CD31-/CD34-/CD45-/HLADR-,可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞;传代培养第3～23代细胞形态无明显变化,生长曲线基本一致,第28代后细胞增长缓慢;流式分析发现第33代细胞较第3代G0/G1减少17.9%、S+G2/M增加103.4%、细胞凋亡率增加316.7%,差异均有显著性意义(P < 0.01),第3～18代细胞间G0/G1、S+G2/M、细胞凋亡率和黏附细胞数差异均无显著性意义(P > 0.05).提示在体外长期培养环境中,随着传代次数的递增,人脐带间充质干细胞的增殖及黏附能力下降,细胞凋亡率增加,总的生物活性呈逐渐下降趋势,其佳生物活性期出现在培养第3～18代之间.
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人脐带间充质干细胞在HIE治疗中的应用
新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemia encephalopathy,HIE)是一种常见的新生儿神经系统损伤性疾病,目前多采用 "三项支持,三项对症"等传统治疗措施,尚无特异性治疗方法.人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,HUC-MSC)是存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞,具有自我更新和多向分化潜能,来源广泛、易于获取、免疫原性低又不涉及伦理问题.其在一定的条件下可分化为神经细胞,分泌神经营养因子,修复脑损伤,促进脑功能恢复.HUC-MSC移植为HIE的治疗提供了一种新的途径.
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注射人脐带间充质干细胞到耻尾肌及膀胱颈对压力性尿失禁的疗效比较
目的 探讨移植人脐带间充质干细胞(hUCMSC)到耻尾肌及膀胱颈对雌鼠压力性尿失禁(SUI)治疗的有效性.方法 40只大鼠分为正常对照组8只和造模大鼠(采用切除双侧卵巢后气囊压迫牵拉阴道壁的方法造模)32只.后者均分为治疗A组、治疗B组:耻尾肌、膀胱颈注射hUCMSC;对照A组、对照B组:耻尾肌、膀胱颈注射生理盐水.注射前、注射后1个月检测大膀胱容积(MCC)、漏尿点压力(LPP)及进行“指压实验”.结果 与正常对照组相比,造模大鼠LPP均低,指压实验阳性率均高,差异有统计学意义(P＜0.05).移植前后治疗A组与对照A组比较:MCC差异无统计学意义(P＞0.05);治疗A组LPP变化不大,对照A组LPP下降,差异有显著统计学意义(P＜0.01).与对照B组比较:治疗B组MCC增加较多,差异有统计学意义(P＜0.05);LPP升高更明显,差异有显著统计学意义(P＜0.01).结论 通过模拟产伤及绝经能获得稳定的SUI动物模型.耻尾肌注射hUCMSC可以提高SUI大鼠的尿道闭合压,但不能改善储尿能力.膀胱颈注射hUCMSC可提高SUI大鼠尿道闭合压的同时改善储尿能力.
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人脐带间充质干细胞干预化疗损伤卵巢模型的生物力学分析
目的 研究化疗损伤大鼠卵巢模型以人脐带间充质干细胞(UC-MSC)干预后的生物力学特性,为化疗损伤卵巢的干细胞治疗疗效提供更多支持证据.方法 取10周龄组Wistar大鼠60只,随机分为对照组20只、化疗损伤卵巢动物模型组(模型组)20只、化疗损伤卵巢动物模型以UC-MSC干预组(UC-MSC组)20只.化疗损伤卵巢动物于饲养第1天采用环磷酰胺(CTX)连续腹腔注射14 d建模.建模完成后对UC-MSC组大鼠通过卵巢注射106 UC-MSC,分别于大鼠饲养第30天、第90天取各组大鼠卵巢进行组织形态观察和拉伸实验.结果 模型组大载荷、大应力、大应变、弹性限度应变、弹性限度载荷、弹性限度应力小于对照组、UC-MSC组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 化疗损伤卵巢动物模型通过以UC-MSC干预,卵巢的组织形态,卵巢的弹性和韧性得到一定的恢复,卵巢的功能具有一定的恢复.
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黄芪多糖联合人脐带间充质干细胞改善糖尿病大鼠心肌病变的机制
目的 从miRNAs角度探讨黄芪多糖(APS)联合人脐带间充质干细胞(HUCMSCs)改善糖尿病(DM)大鼠心肌病变的机制.方法 取正常组(Con)、模型组(DM)及APS联合HUCMSCs治疗组(C)大鼠心肌组织进行miRNAs基因芯片检测,以TargetScan,miRanda,PicTar软件以及miRSystem 网站 (NTU,Taipei,Taiwan)对差异表达的miRNAs的靶基因及其耦联的信号通路进行预测及分析,并采用real-time qPCR验证芯片结果.结果 DM组与Con组以及C组均存在显著差异的miRNAs有8个,其中miR-34a-5p差异明显,其靶基因有220个,可能耦联的信号通路主要有:Notch signaling pathway,p53 signaling pathway,MAPK signaling pathway,Cell cycle,Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC),且real-time qPCR检测miR-34a-5p的相对表达量与芯片结果一致.结论 APS联合HUCMSCs对DM大鼠心肌病变的改善作用可能是通过调控miR-34a-5p的表达实现的.
关键词： 黄芪多糖 人脐带间充质干细胞 miR-34a-5p 糖尿病心肌病变
