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DAPI标记脐带间充质干细胞在颅脑创伤模型大鼠脑内的迁徙和分布
目的 将人脐带间充质干细胞应用DAPI标记后经尾静脉移植入模型鼠体内,观察脐带间充质干细胞在模型鼠体内的迁徙与定位.方法 体外培养脐带间充质干细胞.建立大鼠脑外伤模型,将DAPI标记于培养良好的脐带间充质干细胞上,通过尾静脉注入模型鼠体内；移植后7d处死大鼠,断头取脑,利用荧光倒置显微镜观察脐带间充质干细胞在模型鼠脑内的分布及与损伤神经元细胞的关系.结果 实验成功建立了大鼠脑外伤模型.荧光倒置显微镜观察在模型鼠脑皮质内可见经DAPI标记的脐带间充质干细胞,并能与损伤神经元细胞发生融合.结论 人脐带间充质干细胞移植入宿主体内后可存活并迁徙至损伤的部位.
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人脐带间充质干细胞的分离鉴定及其修复缺血缺氧脑损伤作用
目的:研究人脐带间充质干细胞(UCMSCs)多向分化潜能,了解UCMSCs移植治疗脑缺血缺氧损伤(HIBD)大鼠的神经修复功能.方法:采用组织消化原代贴壁法分离培养人UCMSCs;取第4和10代UCMSCs进行流式细胞术检测间充质干细胞(MSCs)表面特异标志物表达;染色体分型检测染色体是否畸变;进行成神经、骨、脂诱导,了解其多向分化潜能;制备HIBD大鼠模型,穿梭箱测试对照组、HIBD细胞移植组和HIBD组大鼠的主动逃避率(AARR)和未逃避率(NARR).结果:流式细胞术结果显示,类似MSCs样细胞强表达CD29、CD44和CD105,极低表达CD34和CD45,符合UCMSCs的特征.多向分化诱导后的细胞染色和免疫荧光结果显示,UCMSCs可诱导分化为神经样细胞、脂肪细胞和成骨细胞,多次传代后仍可多向诱导,且未发生染色体畸变.穿梭箱测试提示,UCMSCs移植组大鼠在测试的第3、4和5天的AARR高于HIBD组(P<0.05).结论:UCMSCs易获取及纯化,具有多向分化潜能,多次传代功能稳定,可改善脑损伤动物的神经功能.
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二次贴壁法获得的人脐带间充质干细胞的体外安全性及其对1型糖尿病大鼠血糖的调节作用
目的 探讨二次贴壁法获得的人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的体外安全性及其对1型糖尿病(type 1 diabetes,T1D)大鼠血糖的调节作用,为临床T1D的治疗提供实验依据.方法 采用二次贴壁法从人脐带中进行多能干细胞的大规模培养,建立主细胞库(master cell bank,MCB)和工作细胞库(working cell bank,WCB),对干细胞的免疫表型、体外致瘤性、核型、端粒酶进行检测,以确定其体外安全性;通过干细胞体内移植试验初步分析其对T1D大鼠葡萄糖转化能力的影响.结果 以1根20 cm脐带作为材料,经二次贴壁分离扩增后,建立MCB共250管(P3代)、WCB共250管(P5代),每管均4×106个hUCMSCs.MCB和WCB细胞均高表达CD73、CD90、CD105,低表达CD34、CD45、CD14、CD79a和HLA-DR;染色体稳定、无体外致瘤性.将WCB细胞取出复苏扩增1代后移植T1D大鼠,6周内,大鼠血糖水平较对照组(注射等量生理盐水)显著下降(P＜0.05),且体重下降缓慢(P＜0.05);6周后,与对照组相比,移植组大鼠胰岛组织形态明显恢复,肝脏合成葡萄糖转运蛋白能力提高.结论 采用二次贴壁法获得的hUCMSCs所建立的MCB和WCB细胞生物特性一致,且具有良好的安全性.初步移植结果预示,T1D大鼠GLUT蛋白表达提高可能与hUCMSCs改善肝脏糖原合成能力有关.
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人脐带间充质干细胞移植对糖尿病大鼠血清学的影响
目的:观察人脐带间充质干细胞(huMSCs)移植对糖尿病大鼠血糖、胰岛素和血清因子表达的影响.方法:随机选择12只Wistar大鼠通过腹腔注射链脲佐菌素50 mg/kg,血糖高于16.7 mmol/L者定为糖尿病大鼠,再将其随机分为糖尿病组和干细胞组,每组6只,同时选择6只雄性Wistar大鼠为正常组.干细胞组大鼠腹腔注射huMSCs细胞悬液,糖尿病组注射PBS液.分别于注射2周、4周和6周后测定和比较各组大鼠的血糖、血清胰岛素、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素-6(IL-6)的表达.结果:与正常组比较,糖尿病组和干细胞组大鼠的血糖水平均显著升高,胰岛素水平均显著降低(P＜0.01).与糖尿病组比较,干细胞组大鼠注射huMSCs后的血糖水平明显降低,胰岛素水平明显升高(P＜0.05),血清TNF-α和IL-6 mRNA水平均显著降低(P＜0.01).结论:huMSCs移植能显著降低糖尿病大鼠的血糖,促进其胰岛素分泌,同时降低血清TNF-α和IL-6的表达.
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CXCR4慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达
目的:构建趋化因子CXC亚族CXCR4的慢病毒表达载体并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达.方法:用逆转录PCR方法获取CXCR4基因编码区片段,将构建的慢病毒载体质粒pLVTHM-EGFP-CXCR4与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,包装生产慢病毒.用相同滴度的慢病毒转导等量间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSCs),后采用Real time PCR检测CXCR4mRNA、Westem Blot方法检测蛋白质的表达.结果:PCR、酶切和测序结果表明成功的构建了CXCR4基因重组慢病毒载体.同时用该慢病毒载体转染MSCs后可有效地增加MSCs中CXCR4的表达.结论:成功构建了CXCR4的慢病毒表达载体并能在MSCs中表达,为进一步研究其在干细胞移植中的应用奠定基础.
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人脐带间充质干细胞的成脂诱导分化及其相关基因鉴定
目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的分离提取、体外诱导分化为脂肪细胞的能力及其相关基因的表达情况.方法:取新生儿脐带经组织培养法提取后分离培养于αMEM完全培养基中,经大量纯化与扩增后,采用倒置显微镜观察其形态与细微结构;流式技术检测其细胞周期及表面标志;以含有成脂诱导剂的αMEM培养基对P3的hUC-MSCs进行培养,诱导其向脂肪细胞方向分化,对其对诱导后的细胞进行检测.应用油红“O”染色对其进行定性鉴定;应用实时定量RT-PCR对LPL、Leptin的基因含量进行测定.结果:经过组织培养法后,细胞呈贴壁生长,细胞呈梭性或旋涡状,形态不规则,多数有凸起,细胞核较大,核仁明显;第7代以前的细胞具有较强的生长活性;流式技术检测发现此类细胞高表达CD44、CD73和CD105等细胞表面标记,而几乎不表达CD34、CD45、CD31和HLA-DR.培养至第3代的细胞约72.724％的细胞处G1期、S期的细胞仅占18.069％,第7代时G1期细胞约为83.875％、S期为9.606％左右;经成脂诱导剂诱导分化后,细胞经油红“O”染色,分化为脂肪细胞的细胞着色并呈红色,实时定量RT-PCR结果显示该部分细胞表达脂肪细胞的标志性基因LPL和Leptin.结论:P7以前的hUC-MSCs具有较强的生长分化能力,可以向脂肪细胞进行分化并表达一定量的特定标志性基因.
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人脐带间充质干细胞对低氧环境下的肾小管上皮细胞中肝细胞生长因子(HGF)表达的影响
目的:肾脏的急性缺血缺氧性损伤是泌尿外科常见病,以肾小管间质纤维化为主要病理特点,成体干细胞在急性肾脏损伤动物模型中可以促进肾脏结构修复、改善肾脏功能,肝细胞生长因子作为抗纤维化的主要生长因子,在成体干细胞干预的急性肾脏损伤动物模型实验中起重要作用,然而以往的研究对象主要以动物模型为主,成体干细胞对肝细胞生长因子的具体调节机制尚不清.本实验通过体外分离、培养人的脐带间充质干细胞,来干预离体低氧预处理后的大鼠近端肾小管上皮细胞,探讨在体外培养条件下人脐带间充质干细胞对低氧预处理大鼠近端肾小管上皮细胞肝细胞生长因子表达的影响,为今后研究间充质干细胞治疗肾功能损害提供可靠的理论依据.方法:采用贴壁培养的方法无菌条件下分离、培养、传代人脐带间充质干细胞,细胞融合达90％时更换无血清培养基(serum-free medium,SFM)培养24 h,收集细胞上清液即为人脐带间充质干细胞条件培养基(condition medium,CM);大鼠近端肾小管上皮细胞(tubular epithelial cells,TECs)于低氧环境处理1h后,随机分为对照组与CM干预组,分别培养24 h和48 h后检测TECs中大鼠肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的mRNA水平、收集上清液测定大鼠HGF蛋白的含量,同时收集CM干预组中0h,12h、24h、48h的上清液,测定其中人来源HGF蛋白的含量,并对TECs在CM干预24 h和48 h后行免疫组化定性人的HGF蛋白的表达.结果:在低氧预处理的培养环境下,CM干预组中,TECs中大鼠来源的HGF mRNA表达水平在24 h和48 h时明显高于对照组(P＜0.05);上清液中大鼠HGF蛋白的含量在24 h和48 h,CM干预组显著高于对照组(P＜0.05);上清液中人的HGF蛋白的含量随时间进行性增高,免疫组化染色显示在24 h和48 h大鼠TECs中能检测人的HGF蛋白的表达.结论:在低氧预处理的体外培养环境下,脐带间充质干细胞的条件培养基可以显著的上调大鼠自身的HGF水平,并可诱导大鼠TECs合成和分泌人的HGF蛋白,并为探究脐带间充质干细胞治疗肾功能损害提供可靠的理论依据.
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携带白介素-18基因的人脐带间充质干细胞的构建及其意义
目的:构建携带白介素-18(IL-18)基因人脐带间充质干细胞(hUMSCs),为肿瘤靶向性基因治疗研究提供一种工具.方法:体外分离培养hUMSCs,流式细胞仪(FACS)检测hUMSCs的细胞免疫表型.应用基因重组技术将表达IL-18基因的慢病毒转染至hUMSCs,利用RT-PCR及Western blot法检测IL-18的蛋白及mRNA表达水平.结果:成功在体外分离和培养了hUMSCs,流式细胞仪检测结果显示hUMSCs表达CD29、CD44和CD105,而不表达CD34和CD45,符合hUMSCs的表型.成功构建携带IL-18基因的hUMSCs,RT-PCR及Western blot法检测结果提示IL-18基因转染至hUMSCs并能稳定表达.结论:构建携带IL-18基因的hUMSCs并稳定表达IL-18,为肿瘤靶向性基因治疗实验性研究提供了一种新实验工具.
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维甲酸联合音猬因子诱导人脐带间充质干细胞分化为运动神经元
目的:探讨单独和联合应用维甲酸(RA)与音猬因子(Shh)对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)向运动神经元分化的影响,为其进一步临床应用提供理论基础.方法:用双酶消化法提取纯化hUCMSCs,取传至第3代的hUCMSCs,检测表面抗原CD29、CD31、CD34、CD44的表达情况.根据培养液中加入不同诱导剂分为空白对照组,RA组(0.5μg/ml RA),Shh组(300 ng/ml Shh),RA+Shh组(0.5μg/ml RA和300 ng/ml Shh).诱导细胞培养后第25天,观察细胞形态的变化；采用免疫细胞化学检测Nestin、MAP-2、Hb9和GFAP的表达,比较各组阳性率.用免疫印迹检测RA+Shh组诱导后第5、10、15、20、25天Nestin、MAP-2、Hb9的表达情况.结果:流式细胞仪检测结果显示,CD29、CD44高表达,CD31、CD34阴性.空白对照组和Shh组细胞诱导后形态变化不明显,Nestin和MAP-2阳性表达率均很低,两者之间无差别.RA组和RA+Shh组细胞诱导第25天后,细胞胞质以胞核为中心收缩,部分胞质收缩形成细胞的突起,突起之间有网状连接,具有典型的神经元样形态；Nestin和MAP-2的阳性表达率比其他2组增多.4组中只有RA+Shh组细胞诱导后Hb9表达阳性,阳性率为33.62％,其他各组均无Hb9表达.各组GFAP表达阳性率均较低,无差异.免疫印迹检测结果显示,RA+Shh组细胞从第5天起,可见Nestin的表达；第10天少量的MAP-2表达；第15天Hb9开始出现；第20天Nestin下降；第25天MAP-2和Hb9达到本次检测的高峰.结论:RA能促进hUCMSCs向神经元分化,单独使用Shh并没有明显效果,而RA联合Shh能促进hUCMSCs向运动神经元分化.
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鉴定慢病毒携带IL-21转导人脐带间充质干细胞及IL-21活性初探
建立慢病毒携带IL-21转导人脐带间充质干细胞方法,并鉴定IL-21活性.以pRSC-IL-21质粒为模板扩增IL-21基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中,构建成慢病毒载体pHAGE-IL-21,将其包装为成熟慢病毒感染HEK 293T细胞.Western blot分析重组慢病毒感染hUCMSC中IL-21的表达,FCM法检测培养上清对脾细胞的增殖作用.结果显示正确构建了携带IL-21基因的慢病毒表达载体,包装的慢病毒感染HEK 293T细胞后可见绿色荧光表达.含IL-21慢病毒感染的hUCMSC中可检测到IL-21表达,分泌在培养上清中的IL-21具有促使脾细胞增殖活性.
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干扰素-γ增强人脐带间充质干细胞免疫抑制作用的研究
目的:观察干扰素-γ(IFN-γ)增强人脐带间充质干细胞(HUMSCs)在体外对CD4+T细胞增殖的抑制作用.方法:采用胶原酶Ⅱ对人脐带组织进行消化,分离出间充质于细胞(MSCs),贴壁培养,经过传代纯化后,在体外将HUMSCs与CD4+T细胞[健康成人的外周血单个核细胞(PBMC)用免疫磁珠分选得到]共培养,CD4+T细胞用羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记,流式细胞仪测定CD4+T细胞的增殖情况,并通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以及Western blot分别测定未经处理的HUMSCs以及IFN-γ处理后HUMSCs的吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)基因及蛋白表达水平.结果:IFN-γ处理后的HUMSCs能够抑制CD4+T细胞的增殖(P<0.05),而未处理的HUMSCs对CD4+T细胞的增殖抑制作用不显著.IFN-γ处理后的HUMSCs能够表达IDO,而未处理组则不表达IDO.结论:IFN-γ能够通过IDO的表达增强HUMSCs在体外对CD4+T细胞增殖的抑制作用.
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携带血管紧张素转换酶2基因的人脐带间充质干细胞尾静脉注射移植可减轻博来霉素诱导的大鼠急性肺损伤
目的:探讨携带血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)基因的人脐带间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells,HUMSCs)尾静脉注射移植对博来霉素(bleomycin,BLM)诱导的大鼠急性肺损伤(ALI)的可能作用.方法:取正常足月剖宫产健康婴儿脐带分离 HUMSCs,流式细胞术鉴定细胞表面抗原;三质粒共转染法在293T细胞中制备病毒颗粒 Lenti-ACE2,并转染 HUMSCs.大鼠随机分为正常对照组、BLM 组、ACE2组、HUMSCs组、HUMSCs-ACE2组(n=24).后4组大鼠采用一次性气管内滴注BLM(5 mg/kg)建立肺损伤大鼠模型,收集各组大鼠损伤前和滴注BLM后第3、7、14天肺泡灌洗液(BALF)及肺组织进行相关指标检测.计数法测定BALF中性粒细胞数量;BCA法测定BALF总蛋白含量;化学法测定髓过氧化物酶(myeloperoxidase,M PO)活性;H-E染色法观察肺组织病理学形态;RT-PCR测定肺组织中INF-γ、IL-4 mRNA 表达的变化;ELISA 法测定肺组织 TNF-α含量;Western 印迹法测定肺组织 ACE2蛋白表达.结果:HUMSCs组、ACE2组及HUMSCs-ACE2组大鼠BALF中性粒细胞计数在第3、7、14天较同期BLM组呈现下降趋势,其中以HUMSCs-ACE2组降低量明显,差异有统计学意义(P<0.05).与同期BLM 组相比,HUMSCs组、ACE2组及 HUMSCs-ACE2组BALF总蛋白量降低,以HUMSCs-ACE2组降低量明显,差异有统计学意义(P<0.05).肺损伤严重度病理评分结果显示:与BLM相比,ACE2、HUMSCs、HUMSCs-ACE2组大鼠肺组织损伤得到不同程度的改善,尤以 HUMSCs-ACE2组表现佳,在损伤后第3、7、14天差异有统计学意义(P<0.05).与同期BLM组相比,HUMSCs-ACE2组总蛋白中ACE2表达增量明显,第14天达高峰,接近BLM刺激前水平,差异有统计学意义(P<0.05).与同期BLM组相比,HUMSCs组、ACE2组及HUMSCs-ACE2组MPO活性降低,以HUMSCs-ACE2组降低量明显(P<0.05).与同期BLM组相比,HUMSCs组、ACE2组及 HUMSCs-ACE2组INF-γ mRNA水平降低,以 HUMSCs-ACE2组降低量明显(P< 0.05).与同期 BLM 组相比, HUMSCs组、ACE2组及HUMSCs-ACE2组IL-4 mRNA表达升高,以 HUMSCs-ACE2组升高明显(P<0.05).免疫荧光染色表明外源性 HUMSCs携带ACE2/eGFP基因,经静脉输入体内后第14天可见肺组织受损处出现GFP阳性表达细胞.结论:携带ACE2的HUMSCs尾静脉注射移植能有效降低 ALI大鼠肺部中性粒细胞浸润和总蛋白渗出,改善血管通透程度,降低肺组织中促炎因子水平,提升抗炎因子IL-4及ACE2的表达,从而减轻ALI大鼠病理损伤程度.
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体外诱导人脐带间充质干细胞定向分化为肝细胞的研究
目的 对肝组织匀浆上清液(LHS)体外诱导人脐带间充质干细胞(hUCMSC)定向分化为肝细胞的功能特性进行检测.方法 选取第3代hUCMSC,采用LHS作为诱导培养基,实验分为对照组和LHS处理诱导组,每组有3、5、7d三个时间点;诱导后对细胞进行AFP、CK18、TPH2、CYP3A4、Alb、HGF的免疫荧光细胞化学染色;并测定诱导前后CYP3A酶活性、Alb、HGF和尿素的分泌量.结果 LHS诱导3d后细胞表达肝特异性蛋白AFP、CK18、TPH2、CYP3A4、Alb和HGF;对照组hUCMSC不同时间点CYP3A酶特异性代谢底物咪达唑仑的代谢量为0.026～0.030ng/mg,LHS诱导3、5和7d后细胞代谢量分别为(30.14±1.19)、(50.20±6.24)和(120.85±15.52) ng/mg,与对照组相比显著升高(P＜0.01);对照组细胞3、5和7 d HGF的分泌量分别为(0.24±0.14)、(0.42±0.20)和(0.18±0.15) ng/mg,LHS诱导后细胞HGF的分泌量分别为(4.06±1.35)、(3.35±0.17)和(3.83±0.42) ng/mg,与对照组相比显著升高(P＜0.01);LHS诱导后各组细胞尿素分泌量增加14倍以上,与对照组相比显著升高(P＜0.01);对照组3、5和7 d Alb的分泌量分别为(22.66±2.99)、(16.99±2.90)和(15.37±1.86) μg/mg,诱导3、5和7d后Alb的分泌量分别为(36.40±3.53)、(46.66±2.50)和(54.82±4.28) μg/mg,与对照组相比显著升高(P＜0.05或P＜0.01).结论 在体外经LHS诱导后,hUCMSC能够分化为具有成熟肝细胞功能的肝细胞.
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人脐带间充质干细胞剂量递增静脉输注治疗失代偿性肝硬化的安全性研究
目的 探索人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)剂量递增外周静脉输注治疗失代偿性肝硬化的安全性和耐受性,并观察其疗效.方法 采用开放、剂量递增的方法进行前瞻性的安全性研究,随访观察期1年.入组的肝硬化失代偿患者通过外周静脉输注hUCMSCs,输注剂量分为三个级别,即5×107个/次、1×108个/次和2×108个/次,从低剂量级开始,每个级别患者需接受3次同等剂量细胞的输注,按严格规定进行剂量升级.相关不良事件(AE)评价采用美国国立肿瘤研究所NCI-CTC AE 4.0标准.干细胞制备有严格质控,每次输注的干细胞均可溯源.试验严格按照药物临床试验规范(GCP)进行观察和随访.结果 (1)共20例肝硬化失代偿患者纳入研究,显示静脉途径输注hUCMSCs有良好耐受性,大耐受剂量为2×108个/次；(2)输注后患者生命体征、心电图、肾功能等均无异常；(3)20例患者共观察到516次AE,常见与于细胞输注可能相关不良事件有发热、胆红素升高、PT延长、血小板降低等,AE的发生率不随细胞剂量升高而升高；(4)共观察到21起严重不良事件(SAE),仅1例SAE(PT延长)与hUCMSCs输注可能有关,且4d内自行缓解,该患者至今存活；(4)多数患者生活质量改善明显(SF-36评分由基线109上升至127,P＜0.05)；(5)肝功能改善:前白蛋白由基线74.55 mg/L上升至104.61 mg/L (P＜0.01);白蛋白由基线29.50 g/L上升至34.94g/L (P＜0.01);白球蛋白比由基线1.01上升至1.22(P＜0.01)；TBil由基线52.59 μmol/L下降至40.02 μmol/L;CTP评分由基线9.10下降至7.61 (P＜0.05)；MELD评分由基线15.18下降至13.46.(6)1年生存率90％,随访至2年时无一例发生肿瘤.结论 失代偿性肝硬化患者静脉途径输注hUCMSCs是安全的,并具有良好的耐受性.hUCMSCs在一定程度上可能改善患者临床表现.随访2年无肿瘤发生.
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人脐带间充质干细胞治疗严重失代偿肝硬化伴皮肤广泛撕裂伤1例
目的 对严重肝硬化失代偿期伴皮肤广泛撕裂伤患者以人脐带间充质干细胞进行试验性治疗并观察其疗效.方法 以人脐带间充质干细胞多点、多次注射于皮肤创面周围,同时联合静脉输注治疗.结果 人脐带间充质干细胞治疗后10 d,患者皮肤创面周围皮肤水肿消退,渗出减少,肉芽组织及皮岛生长明显,治疗后23 d创面完全愈合;患者CTP及MELD评分分别由入院时的10分及8.31分降至皮肤创面愈合时的7分及5.03分.结论 采用局部注射联合全身输注人脐带间充质干细胞治疗肝硬化失代偿合并皮肤损伤,可明显加快创面愈合,促进大面积破溃皮肤的再生.
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人脐带间充质干细胞对急性肝功能衰竭大鼠肝组织Wnt/β-catenin信号表达的影响
目的 探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSC)对急性肝功能衰竭(ALF)大鼠的疗效及Wnt/β-catenin信号表达的影响,了解hUCMSC移植对ALF大鼠肝脏再生的可能机制.方法 SD大鼠100只腹腔注射D-GalN诱导大鼠ALF模型,5只腹腔注射0.9％氯化钠溶液.造模成功的大鼠50只予以尾静脉注射hUCMSC,作为移植组;50只尾静脉注射0.9％氯化钠溶液,作为模型组.检测两组大鼠ALT和AST水平,比较两组肝脏组织病理学改变及死亡率.实时荧光定量PCR检测两组肝组织中Wnt2、Wnt7a和Wnt7b的表达量;免疫组织化学和免疫荧光技术检测两组β-catenin的表达情况.统计学方法采用成组设计的t检验、Wilcoxon秩和检验.结果 移植组大鼠尾静脉注射hUCMSC、模型组大鼠尾静脉注射0.9％氯化钠溶液ld后,ALT分别为(906.0±76.9)、(1 874.7±191.3) U/L,差异有统计学意义(t=4.697,P=0.009);AST分别为(1 138.0±221.5)、(2 239.7±213.3) U/L,差异有统计学意义(t=3.583,P=0.023).移植组的死亡率明显低于模型组,在1周观察期内,移植组10只大鼠死亡1只,而模型组10只大鼠死亡5只,差异有统计学意义(x2 =4.048,P=0.044),且移植组肝损伤比模型组轻.β-catenin主要在胞质和胞核聚集,且移植组较模型组明显增多.与模型组相比,移植组Wnt2、Wnt7a和Wnt7b基因表达均明显升高,分别为模型组的2.4倍(t=3.950,P=0.017)、3.1倍(t=4.846,P=0.008)和3.0倍(t=2.888,P=0.045),差异均有统计学意义.结论 hUCMSC移植ALF大鼠可以显著改善肝功能,减轻肝脏病理损伤程度,促进肝脏再生,降低死亡率.hUCMSC对ALF大鼠Wnt/β-catenin信号通路的激活可能是促进肝脏再生的机制之一.
关键词： 肝功能衰竭 急性 人脐带间充质干细胞 Wnt/β-catenin -
人脐带间充质干细胞移植治疗晚期外伤性癫痫
目的 探讨人脐带间充质干细胞移植治疗晚期外伤性癫痫的临床价值.方法 对31例晚期外伤性癫痫患者进行人脐带间充质干细胞移植,观察临床效果.结果 癫痫发作完全消失或仅有先兆者21例,极少发作(≤3次/年)者5例,发作明显改善(减少≥75％)者4例,无明显改善(减少＜75％)者1例,满意率83.87％.结论 人脐带间充质干细胞移植对治疗外伤性癫痫具有较好的效果.
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脐带间充质干细胞复合β-磷酸三钙生物陶瓷体内外成骨能力的初步研究
目的:观察人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)和支架材料β-磷酸三钙(β-TCP)生物陶瓷复合的体内外成骨情况.方法:在体外构建hUCMSCs和β-TCP的复合物,将细胞以3×10 5/mL的浓度接种到支架材料上进行复合体构建,并进行电镜观察、特异性免疫荧光染色、MTT、ALP检测.将复合物植入裸鼠体内,进行成骨能力研究.实验分为3组,即植入单纯β-TCP支架组、植入体外成骨诱导2周的hUCMSCs和β-TCP复合物组、单纯植入体外成骨诱导2周的hUCMSCs组.植入后2个月取出标本,进行大体观察、X线片观察和组织学观察.采用SPSS16.0软件包对实验数据进行重复测量随机区组设计的方差分析.结果:hUCMSCs植入支架4h后,即可见细胞在支架上附着,1周后可见细胞在支架中大量增殖,β-TCP具有一定的骨诱导性.复合物植入裸鼠内2个月,hUCMSCs和β-TCP复合组X线密度高.HE染色显示,2个月后,hUCMSCs和β-TCP复合组见不规则新骨和血管形成,单纯β-TCP组未见明显新骨和血管形成.Masson染色显示,2个月后,hUCMSCs和β-TCP复合组见大量胶原形成,单纯β-TCP组未见明显胶原形成.VG染色显示,2个月后,hUCMSCs和β-TCP复合组孔隙中有大量类骨质及少量骨陷窝形成,单纯β-TCP组未见类骨质形成.结论:hUCMSCs和β-TCP具有良好的生物相容性,两者构建的复合物在植入裸鼠体内2个月时可见新骨及血管化形成.
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人脐带间充质干细胞与牙髓细胞体外共培养对细胞生物学的影响
目的:研究人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)与经骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)诱导后的人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)共培养对细胞生物学特性的影响.方法:分别取原代培养的hUCMSCs和hDPCs,分别通过流式细胞术、成骨诱导、成脂诱导以及免疫组织化学染色鉴定细胞;使用BMP2诱导hDPCs,14 d后检查其DSPP、ALP、DMP1的mRNA表达情况;按照1∶1、1∶5、5∶1的比例直接共培养hUCMSCs与经BMP2诱导后的hDPCs,实时定量PCR检测其DSPP、ALP、DMP1、OCN、VEGF、HGF、Nanog的mRNA表达情况.根据实时定量PCR结果选取1∶1组与单独培养hUCMSCs组、hDPCs组比较,分别培养21 d后进行茜素红染色,在酶标仪上于562 nm处检测沉淀物形成情况.采用SPSS21.0软件包对数据进行统计学分析.结果:直接共培养14d后,1∶1细胞组的DSPP、ALP、DMP1、OCN、VEGF、HGF的mRNA表达量比单独培养的hUCMSCs组显著升高(P＜0.05),而Nanog mRNA表达量比单独培养的hUCMSCs组降低(P＜0.05).茜素红染色结果显示,1∶1组的OD值显著高于hUCMSCs组(P＜0.05).结论:将hUCMSCs与经BMP2诱导后的hDPCs按照1∶1比例共培养,可以诱导细胞向成牙本质细胞方向分化,并促进血管生成因子的表达.
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转录因子诱导人脐带间充质干细胞转分化为视网膜色素上皮样细胞的研究
目的 探讨采用关键转录因子将人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)转分化为视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)样细胞的方法.方法 通过流式细胞技术鉴定hUC-MSCs的表面标记分子;通过诱导hUC-MSCs分化成为脂肪、骨和软骨细胞确定其多系分化能力;采用慢病毒包装系统获得分别含有11个转录因子Sox2、Pax6、Rax、Six6、Nr2e1、Otx2、Lhx2、Crx、Mitf-A、Klf4和c-Myc的病毒,并通过感染hUC-MSCs来诱导hUC-MSCs向RPE样细胞分化.结果 hUC-MSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,但不表达CD11b、CD34,CD45和HLA-DR等分子标记,在成脂、成骨、成软骨分化培养基中可分化为脂肪、骨和软骨细胞.视网膜及RPE发育相关的关键转录因子能够将hUC-MSCs直接转分化为RPE样的细胞,并表达ZO-1、RPE65、Bestrophin-1(Best-1)、CK8/18、Cralbp、Mertk、Tyrosinase (Tyr)、PEDF等RPE细胞的特征分子.结论 视网膜及RPE发育相关的关键转录因子可直接将hUC-MSCs分化为RPE样细胞.
