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超声介导质粒GFP转染小鼠H2K成肌细胞的实验研究
目的探讨超声介导基因转染小鼠骨骼肌细胞的作用.方法采用质粒GFP作为目的基因,超声(频率1 MHz,脉冲波,工作周期20%)作用于H2K成肌细胞,分别使用两种空间时间峰值强度(0.5 W/cm2、1 W/cm2),照射时间分别为10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s.流式细胞仪测定GFP阳性细胞率,台盼蓝染色测定细胞生存率.结果较低能量超声(0.5 W/cm2)GFP阳性细胞率总体显著低于较高能量超声(1 W/cm2),超声增强GFP转染H2K细胞的佳条件为:空间时间峰值强度1 W/cm2,照射时间40～50 s.超声作用并未明显增加细胞死亡率.结论超声在增强骨骼肌细胞基因转染领域应用前景广阔.
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超声介导微泡靶向传输基因促血管新生的实验研究
目的探讨超声介导微泡靶向传输血管内皮生长因子VEGF165促心肌血管新生即心肌"分子搭桥"的新途径.方法利用分子生物学方法构建人血管内皮生长因子真核表达质粒pcDNA 3.1-/VEGF165;制备载VEGF165基因脂质体微泡,分析其理化性质和功能,在超声场利用超声辐射向大鼠梗死心肌靶向传输VEGF165;2周后取材,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)评价大鼠心肌中人源VEGF165 mRNA表达,蛋白印迹杂交(Western Blot)观察大鼠心肌VEGF165的蛋白表达,CD34免疫组化微血管密度(MVD)计数半定量法评价超声介导微泡靶向传输VEGF165促梗死心肌血管新生效果.结果①成功构建、克隆血管内皮生长基因VEGF165重组真核表达质粒pcDNA 3.1-/VEGF165,测序分析、酶切鉴定准确无误;②研制的脂质体微泡超微结构显示可粘附或包载DNA,粒度分析显示平均粒径＜5 μm;③在超声介导下该脂质体载基因微泡可靶向传输VEGF165至大鼠梗死心肌,超声介导靶向传输组VEGF165的mRNA、蛋白表达及促血管新生作用(MVD表示)仅次于VEGF165基因心肌注射组.结论超声介导微泡可向大鼠心肌靶向传输VEGF165基因并产生促血管新生效应.
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超声造影剂在基因转移中的作用
基因治疗的方式有体内直接转基因(体内法)和细胞介导的基因治疗(回体法).无论采用何种方式,治疗性的基因必须达到靶细胞,进入细胞核,进而实现基因表达,才能发挥有效的作用[1].但这一基因转移过程仍存在很多问题.本文讨论超声波和超声造影剂在基因转移中的作用.
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超声介导不同种类微泡破裂对基因转移的影响
基因治疗目前在治疗基因缺陷疾病、肿瘤、炎症以及其他临床疾病方面显示出巨大潜力,但作为一种有效的方法,其成功与否很大程度上取决于它所使用的载体是否能以小的毒性、有效地、选择性地将靶基因转移到靶细胞或靶组织.
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肝脏恶性肿瘤基因治疗的研究进展
肝脏恶性肿瘤的发病率、病死率都很高,发病后患者的生存期很短,目前尚无有效的治疗措施.随着分子生物学理论和技术的发展,基因治疗这一新方法已显示出广阔的应用前景.肝脏因其再生能力强、合成多种蛋白质等特点,已成为基因治疗的理想靶器官.
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革兰氏阴性杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性
β-内酰胺类抗生素是世界上应用多的一类抗生素.在过去20年,新一代头孢菌素、单环类抗生素、碳青霉烯类抗生素和含酶抑制剂复方β-内酰胺类抗生素相继在临床上大量应用,使细菌对这类抗生素的耐药问题变得越来越复杂.细菌对抗生素的耐药可通过自身染色体基因或染色体外基因突变而产生,也可通过基因转移而获得.基因接合、转导和转化机制可使细菌从环境基因库中获得各种耐药基因,引起耐药菌流行暴发.G-杆菌是院内感染的重要致病菌,认识它们对β-内酰胺类抗生素的耐药机制以及有关临床问题,对感染的控制和预防具有重要意义.
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说说转基因食品
转基因食物带来的安全性问题是人们所关心的,目前以欧洲为主的许多发达国家正在对这个问题进行着激烈的辩论.这场争论在中国消费者中也造成了一定影响,而且随着技术的发展以及产品投放市场,人们将会更加关注.转基因食品是利用现代分子生物技术,将某些生物的基因转移到其他物种中去,改造生物的遗传物质,使其在形状、营养品质、消费品质等方面向人们所需要的目标转变.以转基因生物为直接食品或为原料加工生产的食品就是"转基因食品".
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肝癌靶向基因治疗载体研究进展〔1〕
目前对于肝癌治疗的研究已经进入分子水平，随着分子生物学的快速发展和基因工程技术的日臻成熟，肝癌的基因治疗已经迅速发展成为继手术切除、放化疗和介入治疗之后一个新的治疗模式。虽然已有许多将目的基因转入活细胞的方法，但仍存在转移效率不高、靶向性不高的问题。因此寻求一种高靶向性、高转染率的方法已成为研究肝癌靶向基因治疗的热点。在肝癌靶向基因治疗过程中，目前常用的治疗基因转移方法主要包括病毒载体和非病毒载体介导的基因转移。
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异种移植模型转人α1,2岩藻糖基转移酶基因小鼠显微注射DNA片段的制备
目的制备转人α1,2岩藻糖基转移酶(HT)基因小鼠显微注射DNA片段.方法引物两端设计酶切识别位点,聚合酶链反应(PCR)扩增HT cDNA全长序列,两端含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切识序列;回收HTcDNA片段并与PMD18-T载体连接,EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切纯化质粒鉴定;EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切pMD18-HT cDNA重组质粒和pCMV-MCS质粒,回收HT cDNA片段和pCMV-MCS质粒片段,进而连接,转化感受态细菌,纯化质粒对其进行酶切、PCR和测序鉴定;Pvu Ⅰ和Not Ⅰ依次单酶切重组质粒pCMV-MCS-HT cDNA,回收大小约2.85kb片段,溶于适量显微注射用缓冲液.结果成功构建了重组质粒pCMV-MCS-HT cDNA,酶切回收了2.85kb的显微注射DNA片段.结论通过基因工程技术可以获得转人HT基因小鼠显微注射DNA片段,包含基因表达元件,可以用于显微注射法建立转人HT基因小鼠.
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增强型绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞体外诱导分化成心肌样细胞研究
急性心肌梗死后心肌细胞的数量减少,致使其向心力衰竭发展.但是现有的治疗手段并不能很好地解决心力衰竭问题,细胞替代治疗和基因治疗为心力衰竭的治疗带来了新的希望[1].而替代治疗的关键问题是种子细胞的选择.间充质干细胞(MSC)具有高度的自我更新和多向分化的潜能,被认为是理想的种子细胞和基因转移的载体细胞,但其在体内的转归是研究的难点[2].近期,我们采用不同浓度的转染液转染.
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冠心病的基因治疗
基因转移为心血管疾病提供了新的治疗途径,常用于治疗重要蛋白质的过度表达和矫正基因的缺陷,如血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)等基因转移,促进血管新生,改善了缺血心肌的供血和冠状动脉侧支循环形成;而反义性基因治疗,在转录或翻译水平上关闭或抑制某些生长因子的基因表达,抑制其合成,从而降低血管内膜厚度,减轻再狭窄程度,为经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)和冠状动脉内支架植入后再狭窄的防治带来新的希望.
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转基因食品的发展现状及安全性评价
转基因食品(Genetically Modified Food,GMF)是指利用基因工程技术改造基因组构成的食品,包括转基因植物、转基因动物和转基因微生物食品[1].主要利用基因工程技术改变基因组构成,将某些生物的基因转移到其他物种中去,改造其生物的遗传物性,并使其性状、营养价值、物种品质向人们所需要的目标转变.
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神经干细胞移植及基因治疗:脊髓损伤修复的新策略
中枢神经系统损伤的治疗已成为世界各国神经科学家关注的焦点.自证实成年哺乳动物中枢神经系统存在有神经干细胞以来,各国学者致力于干细胞的分离、在神经丝裂原诱导下的增殖、通过基因转移技术获得永生化神经干细胞系等研究,并尝试用于中枢神经系统疾病的治疗.本文就脊髓损伤的神经干细胞移植以及神经干细胞作为载体对脊髓损伤进行基因治疗的现状及应用前景进行综述.
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三种阳离子脂质体介导血管内皮细胞基因转染效率的比较
目的:评价不同阳离子脂质体介导基因转染血管内皮细胞的转染效率.方法:实验于2006-12/2007-02在中山大学生化实验室及广州市创伤外科研究所完成.采用增强型绿色荧光蛋白基因为报告基因,分别采用Lipofectin、Lipofectamine、Dosper 3种不同的阳离子脂质体为载体,转染人脐静脉血管内皮细胞.在24孔板中,每孔加入人脐静脉血管内皮细胞悬液(1×106个细胞),各孔分别加入3种不同阳离子脂质体增强型绿色荧光蛋白质粒复合物,分别于培养24,48 h后用荧光显微镜及流式细胞仪测定增强型绿色荧光蛋白在细胞内的表达及转染效率.结果:3种不同阳离子介导的增强型绿色荧光蛋白基因转染的人脐静脉血管内皮细胞内均有绿色荧光蛋白表达,24 h后明显,48 h后达高峰.Dosper介导组绿色荧光细胞百分比明显高于Lipofectin介导组及Lipofectamine介导组,差异有非常显著意义(P＜0.01).结论:Dosper介导的血管内皮细胞基因转染效率较高,较适合作为血管内皮细胞的基因转染载体.
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TH基因修饰的神经干细胞脑内移植对帕金森病模型动物的旋转行为及神经生化的影响
背景:神经干细胞(neuronal stem cells,NSCs)能提供多巴胺能神经元来治疗帕金森病(Parkinson disease,PD),但脑内移植NSCs治疗PD的疗效目前观察结果欠佳.研究显示酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因脑内移植能缓解PD的症状,TH基因修饰的NSCs脑内移植可能使PD的治疗效果出现新的结局.目的:探讨TH基因修饰的NSCs脑内移植对PD模型动物旋转行为和神经生化的影响.设计:完全随机对照实验.地点和对象:本实验选择105只大鼠,在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成.干预:构建pN2ATH反转录病毒载体质粒,用PA317细胞包装,C-418筛选阳性克隆,病毒上清感染NSCs,将NSCs和表达TH的NSCs植入PD大鼠纹状体内,测定移植后不同时间PD大鼠旋转行为改善以及多巴胺和3,4-二羟基苯乙酸(dihdroxy-phenyl acetic acid,DOPAC)含量变化.主要观察指标:PD大鼠旋转行为改善以及多巴胺和DOPAC含量变化.结果:TH基因修饰的NSCs移植8周后能显著降低PD大鼠旋转行为,增加纹状体多巴胺和DOPAC含量,疗效好于单纯NSCs移植组和对照组.结论:TH基因修饰的NSCs脑内移植能增加纹状体多巴胺和DOPAC含量,降低PD大鼠旋转行为,从而对PD大鼠有明显的治疗作用.
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碱性成纤维细胞生长因子基因转移对成骨细胞生长特性的影响
目的:碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)对骨组织的损伤有修复作用,许多体内外实验均表明外源性植入碱性成纤维细胞生长因子能明显促进骨形成过程.观察碱性成纤维细胞生长因子基因转移对成骨细胞生长特性的影响.方法:实验于2003-01/07在解放军广州军区总医院医学实验科完成.成年雄性新西兰白兔.体质量1.5～2.5 kg,采用聚乙烯亚胺(jetPEITM)介导真核分泌表达载体pcDNA3.1-bFGF及非分泌表达载体pEGFP-C3-bFGF转染原代培养的成骨细胞,消化收集转染成骨细胞以及未经转染的成骨细胞,利用血细胞计数器进行细胞计数,绘制细胞生长曲线,同时测定DNA浓度、碱性磷酸酶及骨钙素含量的变化.结果:①未转染的细胞在第8天进入稳定期,而经转染的细胞在第10天才进入稳定期.未转染细胞终达到的细胞数量为(1.70+0.02)x109L-1,而经转染的细胞数量为(2.10±0.03)x109L-1.差异显著(P＜0.05).(②经pcDNA3.1-bFGF转染的成骨细胞的DNA量高,约为(255±20)mg/L,而经pEGFP-C3-bFGF转染的成骨细胞的总DNA量约为(225±20)mg/L,未经转染的成骨细胞的总DNA量为(100±10)mg/L.③pcDNA3.1-bFGF转染的成骨细胞培养至第9天后,碱性磷酸酶分泌量为(8.0±0.22)IU/mL;而未转染的成骨细胞碱性磷酸酶分泌量为(13.12±0.18)IU/mL.经pEGFP-C3-bFGF转染的成骨细胞所分泌的碱性磷酸酶与未经转染的细胞的分泌暈相当,约为(12.56±0.24)IU/mL.④随着培养时间的延长,骨钙素分泌量的变化趋势与碱性磷酸酶相同,但重组质粒转染成骨细胞与未转染细胞终分泌的骨钙素量差异无显著性(P＞0.05).结论:①经pcDNA3.1-bFGF及pEGFP-C3-bFGF重组质粒转染后,成骨细胞的生长特性有一定的变化,与添加外源碱性成纤维细胞生长因子的影响基本相同.②pcDNA3.1-bFGF转染的细胞分泌的碱性成纤维细胞生长因子能够促进细胞分裂增殖,降低碱性磷酸酶的表达,而pEGFP-C3-bFGF转染的细胞不能分泌表达蛋白,难以发挥其生物学功能.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 基因转移 成骨细胞 -
p53基因转移至移植心脏的安全性
背景:课题组前期实验表明野生型p53基因具有抑制移植心脏冠状动脉内膜增厚的作用.目的:研究腺病毒介导的野生型p53基因转移至移植心脏的安全性.方法:以Wistar大鼠为供体,SD大鼠为受体建立大鼠腹腔异位心脏移植模型,在取出供心后,经供心冠状动脉分别注射携带野生型p53基因的重组腺病毒液、携带β-半乳糖酐酶基因的重组腺病毒液和生理盐水800 μL,4 ℃静置30 min后进行心脏移植.结果与结论:移植后 5 d,重组腺病毒液组的供心冠状动脉组织可见野生型P53蛋白的表达.移植后28 d,未见受体大鼠血液生化学指标异常和重要脏器的病理性改变,RT-PCR扩增未见腺病毒E1A区产物.说明在心脏移植中,将腺病毒介导的野生型p53基因转移至移植心脏是安全的.
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反转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞
背景:为方便、准确检测外源细胞在体内的存活情况,需在外源细胞转移标记基因.目的:观察多种细胞因子联合刺激下反转录病毒载体对BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因转移效率的影响.方法:以PA317-GCGPXSN细胞制备病毒上清,NIH3T3细胞测定病毒滴度后,取经过干细胞因子、白细胞介素3、白细胞介素6预培养刺激后的BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞,实验组实施基因转移,流式细胞仪及PCR方法测定基因转移效率.阴性对照组不做基因转移.阳性对照组为PA317-GCGPXSN细胞株.结果与结论:①病毒滴度为1.9×108 CFU/L.②对照组BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞测定的荧光强度数值为0.63%,实验组为76.04%,两组相比差异有显著性意义(P < 0.01).PCR方法扩增到了NeoR基因的特异性片断,结果证实细胞因子预刺激后实施基因转移,可有效地将外源基因转移进入BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因组中.
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基因转移技术在骨组织工程研究中的应用
利用组织工程技术可以再生骨组织,但由于成骨细胞在体外培养过程中成骨表型的逐步丧失及植入体部位局部缺乏生长因子的作用,使得成骨效率,修复效果尤其是修复长段骨缺损的能力仍不令人满意.利用基因转移技术将编码与骨组织再生有关的生长因子的基因片段移至靶细胞中,使之既发挥种子细胞的作用,又可在体内骨组织再生过程中持续高效地分泌生长因子[1],从而为上述问题的解决提供一个新的思路和技术手段.
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聚酰胺-胺型纳米载体的研究进展
聚酰胺-胺型纳米载体是一种高分子多聚物,商品名为superfectTM,因为其形状及表面胺基团的设置精细,故有"人工球状蛋白"之称.它的表面主要为胺基团,具有结合、浓缩药物或DNA的能力,并将它们高效导入各种细胞,通过适当的修饰可以靶向定位,体外显示无明显的细胞毒性,因而可以在医学研究包括药物控释系统充当基因治疗中的基因转移载体,在诊断、监测中都可以起到重大的作用,目前是各学科中的研究热点之一.
