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受体介导的基因转移与基因治疗
基因治疗成功的关键在于将治疗基因靶向性转移到细胞或组织,受体介导的基因转移能满足此要求,很有发展潜力的基因转移方法.然而,要将这种转移方法用于基因治疗,与转移系统有关的万分的化学特性与物理反应,靶细胞的受体表达水平,DNA配体复合物怎样逃逸溶酶体的降解以及包含在复合物中的外源基因的表达等都是至关重要的.本文综述了受体介导的基因转移的基本原理.DNA配体复合物形成的佳条件与性质,影响基因转移与表达的各种因素以及近年来国内外受体介导的基因转移用于基因治疗取得的进展.
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几种脂质体及其转铁蛋白复合物对肺癌细胞系转基因效率的比较研究
目前，体细胞基因转移载体包括两大类：一是病毒载体介导的基因转移；另一是非病毒载体介导的基因转移。本次实验研究主要通过对比观察SA脂质体、Escort脂质体及其转铁蛋白复合物对肺癌细胞系A549的转基因效率。实验分组：①对比观察Escort脂质体、SA脂质体及Es-cort-饱和转铁蛋白复合物介导的转基因效率：空白对照组(实验过程中不加DNA、脂质体或其复合物)；单质粒组(只加入pCMVβ-Gal)；质粒+SA脂质体组(pCMVβ-Gal：SA=1：10，w／w)；质粒+Escort脂质体组(pCMVβ-Gal：Escort=1：10，w／w)；质粒+Escort-转铁蛋白复合物I组(pCMVβ-Gal：Es-cort：饱和转铁蛋白=1：10：10，w／w)；质粒+Escort-转铁蛋白复合物Ⅱ组(pCMVβ-Gal：Escort：饱和转铁蛋白=1：15：15，w／w)；质粒+Escort-转铁蛋白复合物Ⅲ组(pCMVβ-Gal：Es-cort：饱和转铁蛋白=1：20：15，w／w)；质粒+Escort-转铁蛋白复合物Ⅳ组(pCMVβ-Gal：Escort：饱和转铁蛋白=1：15：20，w／w)。②观察转铁蛋白饱和度对转染效率的影响：空白对照组(实验过程中不加DNA、脂质体或其复合物)；质粒+Escort脂质体组(pCMVβ-Gal：Escort=1：10，w／w)；质粒+Es-cort-饱和转铁蛋白组(pCMVβ-Gal：Escort：饱和转铁蛋白=1：15：15，w／w)；质粒+Escort-缺铁转铁蛋白组(pCMVπ-Gal：Escort：缺铁转铁蛋白=1：15：15，w／w)。基因转染：将A549细胞以1×104／孔接种于96孑L培养板，在37℃，5％CO2条件下继续培养24 h；按上述分组进行转染复合物制备；用RMPI1640培养基洗板1次，后加入转染复合物溶液，在37℃，5％CO2条件下持续转染5 h；弃转染液，加入含20％FBS，1μg/ml氢化可的松RMPI 1640培养基，培养48 h；弃培养液，PBS冲洗1次，加入细胞裂解液，使细胞完全破裂；加入含150μmol／L ONPG，20 mmo1／L Tris(pH7．5)，450 μmol／L-β巯基乙醇的底物溶液，在室温下反应1 h；加入1 mol／L Na2CO3终止反应，用酶联反应标识仪在405 nm的波长读取吸光值(A值)。应用完全随机资料的方差分析方法及进行各组间的均数比较。以P＜0．05为有统计意义。
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TNF-α基因转导的Tca8113细胞体外诱导DNL的细胞毒活性
目的:探讨TNF-α基因转导的人舌癌Tca8113细胞在体外能否诱导口腔鳞癌的引流区淋巴结细胞(DNL)而提高起其细胞毒活性.方法:体外用逆转录病毒载体将TNF-α基因导入Tca8113细胞并进行放射灭活,灭活的转基因细胞与来自舌鳞癌患者的DNL共培养后,采用LDH释放改良法检测诱导后DNL对未转基因Tca8113细胞的杀伤活性.结果:转基因Tca8113细胞诱导的DNL对未转基因Tca8113细胞的杀伤活性高于未经诱导的DNL.结论:TNF-α基因修饰的Tca8113细胞能够从肿瘤引流区淋巴结细胞中诱导出高细胞毒活性的免疫活性细胞,诱导出的免疫细胞中可能含有CTL.
关键词： α-肿瘤坏死因子基因 Tca8113细胞系 基因转移 肿瘤 引流淋巴结细胞 细胞毒活性 -
自制阳离子脂质体介导的体内外基因转移研究
目的:研究阳离子脂质体介导体内外基因转移的效率.方法:采用逆相蒸发法制备出包裹TNFα DNA的脂质体,将其与体外培养的靶细胞共育,或将其直接注射至小鼠腹腔内,检测TNF α的分泌水平.结果:TNF α基因转染NIH3T3细胞和腹腔细胞,10 d后均可检测到TNF α的分泌.结论:研制的脂质体不但能将目的基因转移至体外培养的靶细胞中,还可通过腹腔内注射直接将TNF α基因转移至腹腔细胞,稳定表达TNF α.
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肝癌基因治疗研究新进展
肝癌是我国常见的恶性肿瘤,目前治疗方法较多,其中基因治疗是当前热点问题.本文对肝癌基因治疗的几个方面:反义基因治疗、自杀基因治疗、免疫基因治疗、抑癌基因治疗、联合基因治疗、基因载体等方面进行了综述.
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电脉冲介导荧光素酶基因转移高效率的实验研究
目的研究电脉冲介导的基因转移效率及其佳因因转移电脉冲参数.方法用微量注射器将pcDNA3-Luc质粒100μg注射入BALB/小鼠的股四头肌,5min内在注射部位给予不同参数的电脉冲刺激,然后进行荧光素酶活性测定和组织病理切片.结果电脉冲可明显增加荧光素酶基因的表达,电脉冲组的荧光素酶活性(7.26±3.72)×107RLU/mg蛋白是单纯注射组(1.38±1.27)×104RLU/mg蛋白的5262倍(P=0.017).组织病理检查发现电脉冲刺激无严重的肌肉组织损伤.电压100V/cm波宽60ms,脉冲次数10次和频率0.75Hz是佳的电脉冲参数.结论在佳的电脉冲参数条件下,电脉冲介导的基因转移可获得较高的基因表达.
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受体介导TNFα基因转移的实验研究
目的检测受体介导基因转移人肿瘤坏死因子α基因的靶向性和表达效率.方法人转铁蛋白同多聚赖氨酸共价交联,盐键合成交联蛋白和外源基因质粒的超分子复合物,对表达转铁蛋白受体的肿瘤细胞株进行β-半乳糖苷酶和人肿瘤坏死因子α基因转移.结果检测到外源基因表达;转染人肿瘤坏死因子α基因后细胞上清液检测到一过性人肿瘤坏死因子α活性升高.结论受体介导基因转移肯有良好的靶向性,但表达效率低.
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医学论文中转化、转导、转染和感染的辨析
转化、转导、转染和感染是分子生物学实验中基因转移相关的名词,在医学论文中经常使用.它们词形相近、词意容易混淆,医学论文中时常用错."转化"指通过含外源基因的重组质粒载体将外源基因直接导入原核细胞(如细菌);"转导"指通过重组病毒载体将外源基因导入真核细胞或原核细胞;"转染"指重组质粒载体或游离核苷酸在脂质体等介导下进入真核细胞;"感染"在基因转移实验中强调重组病毒载体入侵受体细胞的过程.在使用这4个名词时,应仔细分析基因转移实验的4要素--转移物、载体、介导方法、受体细胞类型,而正确区分载体和受体细胞类型是辨析的关键点.当载体是重组质粒时,如受体细胞是原核细胞应使用"转化",如受体细胞是真核细胞则使用"转染";当载体是重组病毒时,如强调转移物进入受体细胞应使用"转导",如强调重组病毒载体进入受体细胞的过程则使用"感染".
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血管内皮生长因子的基因克隆与表达
目的构建编码正反义血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)的真核表达质粒,观察质粒转染体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)后,靶细胞VEGF的分泌及细胞生长速度是否发生改变.方法RT-FCR从人胚胎肾组织中获hVEGF165的cDNA片段,构建编码正反义hVEGF165真核表达质粒(pCR3.1/anti-VEGF165及pCR3.1/VEGF165),通过脂质体介导将质粒转入HU-VEC细胞,ELISA测定转染后细胞VEGF的分泌量,设空载体组及未转染的细胞为对照.筛选稳定表达外源基因的细胞克隆,在相差显微镜及透射电镜下观察转染后细胞形态是否发生变化,MTT方法检测细胞生长曲线是否有改变.结果DNA测序结果,获得重组质粒pCR3.1/anti-VEGF165与pCR3.1/VEGF165所携带的外源基因序列与文献报道的基本一致.质粒转染后靶细胞形态均无明显变化,仅在透射电镜下观察到与蛋白质合成相关的细胞器结构发生了相应的改变.反义VEGF转染明显降低靶细胞VEGF的分泌量,抑制率为67.7%(P＜0.01),同时细胞生长速度明显减慢(P＜0.05).而转入正义基因的细胞VEGF的分泌量则能明显提高,与空白对照组比较增长率为984.8%(P＜0.01),细胞生长速度较对照组增快(P＜0.05).结论本实验获得的编码正反义VEGF165的真核表达质粒均能在HUVEC细胞中表达,并有效调节靶细胞VEGF分泌量,改变靶细胞的生长速度.
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逆病毒载体介导的双耐药基因在小鼠骨髓细胞的转移
目的增强造血细胞对化疗药物的耐受性,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率及耐药基因导入在造血细胞保护性基因治疗中的作用.方法应用电穿孔基因转移法将逆转录病毒载体G1Na-MGMT-IRES-MDR1导入病毒包装细胞GP+E86及PA317,以VCR加压筛选后的阳性克隆上清感染小鼠骨髓细胞,应用PCR、Southern bbt及流式细胞仪检测耐药基因MGMT及MDR1在细胞中的转移与表达.结果加压筛选及乒乓效应使病毒滴度由(0.2～7.6)×104 CFU/mL提高到(1.9～5 7)×106CFU/mL,从DNA、RNA及蛋白水平上分别证实了双耐药基因在小鼠骨髓细胞中获得了有效转移和表达,而转基因后的小鼠骨髓细胞对VCR、高三尖杉酯碱和BCNU的耐药性比未转导细胞分别提高了5.7、5.0和8.5倍.结论双耐药基因成功导入小鼠骨髓细胞为肿瘤基因治疗的临床研究提供了实验基础.
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腺病毒介导p21基因转染抑制人血管平滑肌细胞增殖的研究
目的研究抗增殖性p21基因转染对体外培养的人血管平滑肌细胞(HVSMC)的增殖抑制作用及其作用机制.方法通过腺病毒介导将外源性p21基因转入HVSMC,通过免疫印迹法(Western blot)检测p21基因的表达,原位末端标记法(TUNEL)、DNA片段梯度分析及流式细胞分析(FCM)观察靶细胞的细胞周期变化及凋亡,利用酶联免疫光度仪分析靶细胞的增殖抑制情况.结果 Western blot结果显示p21基因转染后的HVSMC可高水平表达p21蛋白,而另两组无表达.感染后5 d,Adp21组的细胞数为0.275 5±0.01(525 nm波长下吸光度A值),AdlacZ组为0.340 9±0.02,空白组为0.347 5±0.02,Adp21组较另两组的差异有统计学意义(P＜0.01).TUNEL、DNA片段梯度分析及FCM检测均提示靶细胞发生了凋亡.FCM检测还发现明显的细胞周期阻滞现象,Adp21组G0-G1期细胞比例为66.23%,S期细胞比例为10.18%,而另两组G0-G1期和S期细胞比例分别为:47.73%、30.56%和45.31%、32.34%.结论复制缺陷性腺病毒在体外可有效介导外源性p21基因转染HVSMC,转染后的细胞除发生细胞周期阻滞外还出现明显的凋亡,其生长增殖受到抑制.
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基因治疗中非病毒载体的基因导入方法
随着基因治疗研究的深入,人们发现,基因治疗的关键是选择恰当的载体及导入方法,使目的基因获得靶向性导入,稳定有效的表达,可控性增强.目前用于基因治疗的载体有两种:病毒载体和非病毒载体.虽然基因治疗的临床实验研究多采用病毒载体,但是不同的病毒载体由于各自存在许多不足,如潜在致癌性、自身免疫原性以及目的基因容量小、靶向特异性差等,限制了它的应用.而非病毒载体,具有低毒、低免疫反应、不发生外源基因随机整合等优点,越来越受到重视.非病毒载体的基因导入方法主要可分为物理方法和化学方法两种.本文对非病毒载体的基因导入方法方面的研究进展作扼要综述.
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血管内皮生长因子165基因转染小鼠硬皮病皮损的实验研究
目的:探讨硬皮病基因治疗的新方法.方法:建立小鼠硬皮病动物模型后,应用电穿孔技术将血管内皮生长因子(VEGF)165真核表达质粒导入硬皮病小鼠硬化的皮下;再利用免疫组化、原位杂交法检测小鼠硬皮病皮损VEGF165的表达及观察组织病理改变.结果:①转基因后硬皮病鼠毛发生长明显增多,而未转基因硬皮病鼠毛发未见生长.②组织病理检查示转基因鼠毛囊明显增生,毛囊数每一低倍视野平均为(12.0±1.6)个,显著高于未转基因硬皮病鼠组(P＜0.05).真皮厚度增加,新生血管增加.③免疫组化、原位杂交法检测示转基因鼠表皮和真皮细胞及间质VEGF165表达明显增加.结论:电穿孔技术可将外源性基因转入小鼠硬化的皮肤,使其高表达.外源性VEGF165基因转染后,可明显促进小鼠硬化的皮肤毛发生长,已萎缩的真皮组织增生.
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重组腺病毒载体转染 CTLA4Ig基因在毛乳头细胞中的表达
目的探讨免疫耐受基因 ( CTLA4Ig) 在毛乳头细胞中的表达 , 为毛乳头细胞移植后产生免疫耐受提供理论和实验依据 . 方法通过构建的重组腺病毒载体将免疫耐受基因 ( CTLA4Ig) cDNA导入培养的毛乳头细胞中 , 并将体外基因转染的毛乳头细胞移植到小鼠体内 , 通过组织学和免疫组化检测目的基因在体内和体外的表达 . 结果 CTLA4Ig蛋白在基因转染 6 h后即在细胞浆中表达 , 随着转染时间的延长其表达逐渐增加 ; 基因转染的毛乳头细胞移植到小鼠体内 , 目的基因在 24 h开始表达 , 能持续表达 2周 ; 移植细胞未受到免疫排斥 . 结论带有 CTLA4Ig基因的毛乳头细胞在体外和小鼠体内能较长时间存活并表达 CTLA4Ig.
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SSTR亚型调变与188Re-SSA抑瘤效应相关性研究
研究小细胞肺癌的治疗学基础,探索其生长抑素受体(简称SSTR)介导的放射性核素标记的特异配体靶向治疗方案具有重要意义,下面叙述有关研究现状.1.肿瘤生长抑素受体亚型表达的研究现状.20世纪80年代前后各国学者对促生长素抑制素(简称生长抑素,SST)的多种生理、药理作用进行了深入研究,并着重研究了SST及其类似物(简称SSA)的抑瘤效应,而SST或SSA作用的实现均是通过靶细胞膜上高特异性的SSTR介导的.1992～1995年间SSTR的5种亚型(简称SSTR1～5)先后克隆成功,组成结构和功能各异的SSTR家族(SSTRs)[1].近年研究表明胺前体摄取与脱羧瘤(简称APUD瘤)及其转移灶均有SSTRs的表达,其表达密度显著超过肿瘤周围的SST靶组织,故采用SSTR1～5亚型作探针的原位杂交法可检测各类肿瘤SSTR1～5的表达模式.初步研究表明人体各类各型肿瘤表达SSTR亚型的模式各不相同[2],多数APUD瘤以表达SSTR2和(或)SSTR1为主,具有APUD瘤某些特征的小细胞肺癌(简称SCLC)也以SSTR2的表达占优势[3].文献报道SSA的抑瘤效应主要由SSTR2介导[3].近年发现人胰腺癌失去表达SSTR2的能力,若通过基因转移将SSTR2再导入该癌细胞内,即可在实验模型上获得
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内皮抑素基因抗肿瘤血管生成疗法研究进展
内皮抑素具有较强的抗肿瘤血管生成作用.文章就肿瘤血管的生成及调控;内皮抑素的基本结构、分布和激活、抗血管生成的优点及抗肿瘤血管生成疗法的研究进展作一综述.
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IL-2基因转导CD3AK细胞免疫学功能的研究
目的：观察白细胞介素-2(IL-2)基因转导后CD3AK细胞免疫学功能的变化。方法：应用逆转录病毒载体将IL2基因转导入CD3AK细胞。检测转导细胞中特异性NeoR基因、培养上清IL2的表达水平及转导CD3AK细胞的体外增殖活性、细胞毒活性和细胞表型。结果：从转导细胞mRNA中扩增出长度为347bp的特异性NeoR基因片段，转导细胞培养上清的IL2表达水平显著增高，体外增殖活性和细胞毒活性均强于未转导组细胞，CD4+/CD2+值升高。结论：PLIL2SN逆转录病毒转导CD3AK细胞后，IL-2基因得到表达并增强CD3AK细胞的免疫学功能。
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逆转录病毒载体PLIL-2SN转导人CD3AK细胞方法的建立
目的:探讨CD3AK细胞在基因治疗中的应用,并对逆转录病毒载体转导CD3AK细胞IL-2基因的方法进行研究.方法:利用逆转录病毒载体PLIL-2SN向人CD3AK细胞中导入IL-2基因.结果:从转导细胞中RT-PCR扩增出347bpNeoR基因特异性片段,并测出培养上清液中IL-2浓度为3.276μg·L-1.结论:转导的IL-2基因得到表达,转导成功.这有助于进一步研究转导后淋巴细胞的功能,以开展基因免疫治疗的研究.
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重组腺病毒载体介导FasL治疗人脑胶质瘤实验研究
目的:研究以重组缺陷型腺病毒为载体的Fas配体(Fas-Ligand,FasL)基因治疗人脑胶质瘤.方法:用RT-PCR方法构建携带人FasLcDNA的缺陷型重组腺病毒载体(Ad-FL),在体外转导5株人脑胶质瘤细胞;体外检测Ad-FL对人脑胶质瘤细胞生长的影响;建立裸鼠皮下人胶质瘤模型,给予体内治疗.结果:体外实验证实Ad-FL能显著诱导5株胶质细胞瘤在体外凋亡或抑制其生长;体内试验表明重组腺病毒可以在体内有效表达FasL,且能有效通过诱导凋亡和/或炎症反应抑制U251胶质瘤的生长,使荷瘤鼠存活90天以上,而Ad-LacZ和对照组分别为(19.6±2.4)天和(15.8±1.9)天(P＜0.01).结论:以重组腺病毒为载体的FasL基因治疗脑胶质瘤效果显著,将是一种基因治疗脑胶质瘤的新手段.
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重组逆转录病毒介导的人载脂蛋白AI基因在肌源细胞中的表达
目的探索一种安全有效的载脂蛋白AI基因表达系统.方法构建含人载脂蛋白AI cDNA的双顺反子逆转录病毒载体pLAEN,用其转化小鼠原代肌母细胞及肌源性细胞C2C12,ELISA法检测细胞液中人载脂蛋白AI的含量.结果转化后的小鼠原代肌母细胞及C2C12细胞在分化为肌管细胞后均获得异源表达人载脂蛋白AI的能力;而且经G418筛选也获得稳定转化的C2C12细胞株,30天后仍保持有效表达人载脂蛋白AI的能力.结论提示肌源性细胞在体外,以含人载脂蛋白AI cD-NA的逆转录病毒载体进行基因修饰后再移植回骨骼肌,有可能成为动脉粥样硬化基因治疗的一种可行方法.
