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CD28/B7共刺激信号及其临床意义
T细胞活化需要两个信号,一个是抗原特异的,由T细胞受体识别并结合抗原呈递细胞表面的MHC-抗原肽的第一信号;第二信号是由T细胞上的CD28与抗原呈递细胞上的B7分子的结合而提供的.只有两个信号都存在时,T细胞开始增殖并分泌细胞因子.CTLA4是B7的另一个受体,它在T细胞活化时上调表达,其功能为抑制T细胞增殖.阻断或给予第二信号,可以人为调节免疫应答使之增强或抑制,对免疫治疗提供了新的手段.阻断CD28/B7途径导致免疫耐受,降低机体的免疫应答,可应用于自身免疫性疾病、器官移植及移植物抗宿主病的治疗.激活CD28/B7途径可应用于免疫系统识别并清除侵犯免疫系统的肿瘤.
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中国HIV/AIDS患者T细胞及调节性T细胞CTLA-4表达与疾病进展关系研究
目的 对中国HIV感染者T细胞及凋节性T细胞CTLA-4表达与HIV疾病进展的相关性进行研究,探讨CTLA-4在HIV感染中的作用.方法 选取58名HIV/AIDS患者(长期不进展组、无症状HIV组、AIDS组),应用流式细胞仪胞内染色技术检测T细胞及CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞内CTLA-4表达水平,分析其与CD4+T细胞、病毒载量、淋巴细胞活化凋亡水平的相关性.结果 长期不进展组、无症状HIV组、AIDS组CD4+T细胞内CTLA-4表达水平依次增岛(P<0.05);与CD+T细胞显著负相关(P<0.01),与CD8+T细胞活化(CD38表达)、凋亡水平(CD95表达)及CD4+T细胞凋亡水平显著相关(P<0.05),与病毒载量无显著相关性.长期不进展组、无症状HIV组、AIDS组CD8+T细胞内CTLA-4表达水平差异无统计学意义;与CD4+T细胞、病毒载量、CD4,'+>、CD8+T细胞活化及凋亡水平均无显著相关性.CD4+CD25+Foxp3+T细胞内CTLA-4表达水平长期不进展组明显低于无症状HIV组及AIDS纽(P<0.05);与CD4+T细胞显著负相关(P<0.05);与CD4+、CD8+T淋巴细胞活化(HLA-DR表达)显著相关(P<0.01).结论 中国HIV感染者CD4+T细胞及CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞内CTLA-4表达水平与疾病进展及免疫活化状态显著相关,参与HIV感染免疫平衡的调节.
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CTLA4Ig基因修饰的骨髓基质细胞抑制淋巴细胞活化的实验研究
目的研究CTLA4Ig基因修饰的骨髓基质细胞(BMSCs)对淋巴细胞活化的抑制效应.方法 CTLA4Ig重组腺病毒载体转染BMSCs,以RT-PCR、免疫细胞化学、蛋白印迹法检测CTLA4Ig的表达情况,MTT法、ELISA法观察转染上清对混合淋巴细胞反应(MLR)体系中淋巴细胞活化、增殖的抑制效应.结果转染组及转染后传两代BMSCs中检测到CTLA4Ig基因的转录,CTLA4Ig弥漫表达于细胞浆;转染后检测培养上清CTLA4Ig即呈阳性,72h达高峰,传一代培养上清中仍可检测到;转染上清对淋巴细胞的增殖、IL-2分泌有明显的抑制作用.结论 CTLA4Ig重组腺病毒能有效介导CTLA4Ig基因在BMSCs中的表达,且CTLA4Ig能有效抑制淋巴细胞的活化、增殖.
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黑素瘤免疫治疗药物研究进展
黑素瘤是常见的皮肤恶性肿瘤,其恶性程度高,侵袭性强,患者预后极差.但自201 1年以来多个新药陆续上市,尤其是免疫治疗药物优势凸显.例如,CTLA4抗体药物(ipilimumab)和PD-1/PD-L1抗体药物(nivolumab,pembrolizumab)大幅提高黑素瘤患者的客观有效率;IL-2瘤内给药和L19-IL2融合蛋白药物也取得令人瞩目的临床进展.本文从免疫检查点抑制剂、被动免疫、主动免疫、过继免疫等方面,对迄今已上市和即将上市的黑素瘤免疫治疗药物进行介绍,利于临床用药,也为新药研发提供思路.
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移植耐受研究进展
过去20年研制的免疫抑制药物使移植物的短期生存得以提高,但未能实现免疫耐受,几乎所有的移植耐受者需要终生服用药物.
关键词： 移植耐受 CTLA4 CD28 CD40L免疫抑制剂 T细胞 -
联合阻断CD28/B7和ICOS对同种异体C57BL/6小鼠皮肤移植的影响
目的 探讨CD28/B7共刺激通路阻断剂和ICOS/ICOSL共刺激通路阻断剂对同种异体小鼠皮肤移植的影响.方法实验动物随机分为4组,每组6只,供体、受体均为C57BL/6.CTLA4Ig处理组；ICOS Ig处理组；CTLA4Ig+ ICOS Ig处理组；空白对照组.将C57BL/6小鼠背部全层皮肤移植于同种小鼠中段背部.前3组分别以150mg/kg的抗体经腹腔注射,空白对照组只注射同等量的生理盐水,注射时间为皮肤移植后0、2、4d,术后观察皮肤存活情况.术后6d分别处死各组受体鼠和供体鼠,取受体脾脏淋巴细胞与供体脾脏淋巴细胞作混合淋巴细胞反应( MLR),用MTT法测定细胞活力和细胞增殖反应.术后7d切取皮肤移植物作组织学分析.结果与对照组相比,各阻断剂单独治疗组能明显延长移植物的存活时间(P＜0.05),各阻断剂治疗组淋巴细胞对供体淋巴细胞产生特异性低反应(P＜0.05),能有效抑制淋巴细胞对同种抗原的免疫应答.组织学检查发现,各抗体治疗组移植皮肤结构基本正常.结论CTLA4Ig、ICOS Ig可以抑制免疫应答,诱导移植皮肤发生免疫耐受,延长存活时间.
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011 CTLA4-Ig在器官移植术后免疫排斥反应中的应用
CTLA4Ig是一种新型、高效的免疫抑制剂,主要通过竞争性抑制CD28与B7的结合来阻止共刺激信号的传递,抑制抗原特异性T淋巴细胞的增殖活化,未达到抑制免疫反应及诱导免疫耐受的作用,且无明显的毒副作用,因而在器官和组织移植排斥的防治和一些难治性自身免疫性疾病的治疗中有着广阔的应用前景.
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CD28:CTLA4/B7及CD40/CD40L在炎症性肠病发病机制中的作用
炎症性肠病(IBD)是一组病因未明的累及肠道的免疫反应异常性疾病,T细胞功能失调与IBD发病密切相关.CD28:CTLA4/B7及CD40/CD40L是重要共刺激分子,对调节免疫具有非常重要的作用,可能在IBD发生和发展中起着关键作用.
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定向编辑CTLA4基因的向导RNA体外合成体系的构建及其编辑效率
目的:基于CRISPR/Cas9基因编辑技术原理体外合成定向编辑细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA4)基因的向导RNA(small guide RNA,sgRNA).方法:(1)使用Crispr网站对CTLA4位点的sgRNA进行预测并设计出3个sgRNA (sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3),构建sgRNA重组质粒,将其转染293T细胞,48 h后提取基因组DNA,利用T7EN1核酸内切酶筛选活性较高的sgRNA序列;(2)以筛选到的sgRNA重组质粒为模板,设计引物并用PCR扩增体外合成sgRNA的DNA模板片段,进一步优化体外转录条件,转录出sgRNA,并利用Cas9核酸酶体外检测转录纯化sgRNA的切割效率;(3)将sgRNA与转录得到的Cas9 mRNA电转化入肺癌患者CD3+T细胞,实现靶基因敲除.结果:T7EN1核酸内切酶实验证实了sgRNA2序列靶向敲除效率高,效率达到66％;优化体外合成体系后,转录得到的CTLA4 sgRNA2产量高,具有较高的活性,在靶点上成功切开了DNA双链,Cas9核酸酶检测出其切割效率达到了65％;终可在肺癌患者CD3+T细胞中有效敲除CTLA4基因,CTLA4分子的表达从46％降低到22％,T7E1核酸内切酶实验进一步证实了其编辑效率为56％.结论:体外成功构建了具有较高编辑效率的定向编辑CTLA4基因的sgRNA,为后续针对该基因制定相应的免疫治疗策略奠定了基础.
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免疫介导再生障碍性贫血小鼠骨髓T细胞表面CD28、CTLA4水平检测及其意义
目的研究免疫介导再障小鼠骨髓T细胞CD28、CTLA4的表达及其意义.方法建立免疫介导再障小鼠模型,取再障和正常组小鼠骨髓单个核细胞(BMNC),在终浓度为15μg/mL植物血凝素(PHA)条件下培养,于0h和48h分别用双色免疫荧光标记流式细胞术对T细胞CD28、CTLA4的表达进行分析.结果 PHA刺激培养48h后正常组和再障组T细胞CD28、CTLA4的表达较刺激前均明显升高(P<0.01);而且再障组刺激培养前后T细胞CD28的表达均显著高于同期正常组(P<0.01),但CTLA4的表达与同期正常组相比虽略有升高,但差异无显著性(P>0.05).结论再障T细胞激活及其激活潜能增强,免疫分子CD28、CTLA4在骨髓中的表达异常可能参与了再障T细胞的免疫功能紊乱.
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重组腺病毒载体转染 CTLA4Ig基因在毛乳头细胞中的表达
目的探讨免疫耐受基因 ( CTLA4Ig) 在毛乳头细胞中的表达 , 为毛乳头细胞移植后产生免疫耐受提供理论和实验依据 . 方法通过构建的重组腺病毒载体将免疫耐受基因 ( CTLA4Ig) cDNA导入培养的毛乳头细胞中 , 并将体外基因转染的毛乳头细胞移植到小鼠体内 , 通过组织学和免疫组化检测目的基因在体内和体外的表达 . 结果 CTLA4Ig蛋白在基因转染 6 h后即在细胞浆中表达 , 随着转染时间的延长其表达逐渐增加 ; 基因转染的毛乳头细胞移植到小鼠体内 , 目的基因在 24 h开始表达 , 能持续表达 2周 ; 移植细胞未受到免疫排斥 . 结论带有 CTLA4Ig基因的毛乳头细胞在体外和小鼠体内能较长时间存活并表达 CTLA4Ig.
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人CTLA4单克隆抗体的制备和鉴定
目的:制备人的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)的单克隆抗体. 方法:利用蛋白纯化技术获得人CTLA4 Ig蛋白免疫Balb/c小鼠.取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞NS1融合,用ELISA法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并用Western印迹和流式细胞检测仪鉴定所制备的单克隆抗体. 结果:获得一个稳定的分泌抗人CTLA4的杂交瘤细胞株.该细胞克隆培养上清中所含的单抗能和经过PHA刺激后的人T细胞结合,但不能和经过PHA刺激后的小鼠T细胞结合. 结论:利用重组人CTLA4 Ig制备获得高特异性的抗人CTLA4单克隆抗体.
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小鼠CTLA4-Ig融合蛋白的表达、纯化及活性测定
目的:在真核细胞中表达CTLA4-Ig融合蛋白,获得纯品并测定其生物学活性.方法:用电转染的方法将真核表达载体pREP7-CTLA4-IgG2c转染SP2/0细胞,经300μg/ml的潮霉素筛选得到阳性克隆;大量培养后收集合有重组CTLA4-IgG2c的细胞培养上清,用rProteinA亲和层析柱纯化CTLA4-Ig.用还原和非还原性SDS-PAGE和蛋白印迹进行鉴定.采用单向混合淋巴细胞培养(3H掺入法)测定CT-LA4-Ig对T细胞增殖的抑制效应.结果:阳性克隆大量培养的细胞上清经rPrtotein A亲和层析后得到纯化CTLA4-Ig.还原条件下SDS-PAGE和Western blot的结果显示在55 KD出现目的蛋白条带;在非还原条件下SDS-PAGE和Western blot在130 KD处出现目的蛋白条带.混合淋巴细胞培养5 d的结果显示,CTLA4-Ig浓度为10μg/ml时可以抑制T细胞的增殖;20 μg/ml时抑制达到大程度(P＜0.05);继续增加CTLA4-Ig的浓度,其抑制作用不再增强.3、7 d时的抑制作用不明显.结论:在SP2/0中表达了小鼠CTLA4-Ig融合蛋白,该融合蛋白能抑制T细胞的增殖.
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深圳地区CTLA4基因SNPS与儿童哮喘易感性研究
目的 初步探讨哮喘易感基因CTLA4单核苷酸多态性(-318C/T、+49 A/G、-443 A/T、-658C/T、-994A/G、-1147C/T SNP位点)在深圳哮喘患儿中的基因频率和基因型频率.方法 分别收集深圳地区40例哮喘患儿及正常儿童外周血标本,应用基因测序技术对-318C/T、+49A/G、-443 A/T、-658C/T、-994 A/G、-1147C/TSNP位点进行研究,分析在深圳地区儿童中其多态性、基因频率与哮喘之间的关系.结果 在哮喘组和对照组中,-318C/T、-443 A/T、-1147C/T位点多态性、基因频率无明显差异(P＞0.05);+49A/G、-658C/T、-994A/G位点基因型及基因频率均有显著性差异.结论 在深圳哮喘儿童中+ 49A/G、-658C/T、-994 A/G位点多态性可能发生的频率较高,-318C/T、-443 A/T、-1147C/T位点多态性的发生频率较低.
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腺病毒介导的hCTLA4-Ig和FasL基因转移诱导大鼠同种异体肾移植长期存活的作用
目的 探讨腺病毒介导hCTLA4-Ig和FasL基因转移延长异基因大鼠肾移植物存活时间及其相关机制.方法 供、受者分别为SD系大鼠和Wistar系大鼠,建立大鼠肾移植模型.实验分为4组:对照组、空载病毒Ad-EGFP处理组、Ad-CTLA4-Ig处理组、Ad-CTLA4-Ig+Ad-FasL处理组.对照组不予处理,其他各组在供肾冷保存时,经供肾动脉灌注(1×10~9-5 ×10~9)PFU/ml Ad-EGFP、Ad-CTLA4-Ig、Ad-CTLA4-Ig+Ad-FasL.术后比较各组的存活时间、移植肾组织学、肾功能和免疫组织化学等的改变.结果 肾移植受者平均存活时间Ad-CTLA4-Ig+Ad-FasL处理组(64.67±6.41)d、Ad-CTLA4-Ig处理组(31.33 ±6.77)d与对照组(8.17±1.17)d,空载病毒Ad-EGFP处理组(8.00±1.55)d比较明显延长(P均＜0.01),并且Ad-CTLA4-Ig+Ad-FasL处理组优于Ad-CTLA4-Ig处理组(P＜0.01);对照组和空载病毒Ad-EGFP处理组术后血清肌酐浓度迅速上升,其余两组移植肾功能保持稳定.结论 Ad-CTLA4一Ig和Ad-FasL介导的基因转移能够诱导异基因肾移植物长期存活;该效应为供体特异性,与调节性T细胞和同种反应性T细胞的删除有关.
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地塞米松对儿童原发性系膜增生性肾炎外周血淋巴细胞CTLA-4表达和凋亡的影响
目的 原发性系膜增生性肾炎(MsPGN)的发病机制和糖皮质激素(GcC)耐药机制虽然部分已明确,但其确切机制仍未阐明.细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)是T细胞活化的重要抑制性分子.本研究探讨MsPGN患儿外周血淋巴细胞CTLA-4表达和淋巴细胞凋亡及地塞米松(Dex)对其影响.方法 分别采用直接免疫荧光、流式细胞仪及Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测:Dex处理或非Dex处理的MsPGN组和对照组体外培养外周血淋巴细胞膜CTLA-4的表达和其凋亡.结果 体外培养MsPGN组淋巴细胞CTLA-4的自然表达和Dex诱导的表达均较对照组低(P<0.05);MsPGN组淋巴细胞自然凋亡和Dex诱导的凋亡亦较对照组低(P<0.05),且两者均呈正相关性(P<0.05).结论 CTLA-4表达异常可能参与了MsPGN的发病机制及GC耐药机制.
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以Bacmid-杆状病毒系统表达人CTLA4胞外区蛋白的研究
目的在Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统中表达人CTLA4.方法采用PCR技术,自pUC19-CTLA4Ig质粒中获取人CTLA4胞外区cDNA,将其克隆入pFastBac1质粒中,经DNA自动测序仪进行DNA序列鉴定,并进一步将其转座入Bacmid中,在昆虫细胞HzAM1中进行表达,采用SDS-PAGE对表达产物进行分析.结果在昆虫细胞表达系统中表达出完全糖基化的人CTLA4胞外区重组蛋白.结论人CTLA4胞外区cDNA在Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统中得到了表达.
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人CTLA4胞外区突变体在毕赤酵母中的高效表达
目的根据毕赤酵母密码子偏好,设计并改造人CTLA4胞外区cDNA,构建毕赤酵母分泌型表达载体,以实现人CTLA4胞外区蛋白在毕赤酵母中的高效表达.方法利用PCR定点突变技术,将人CTLA4胞外区cDNA中的毕赤酵母低频使用密码子突变成高频使用密码子而不改变其氨基酸序列;经DNA序列测定证实后插入毕赤酵母高拷贝表达载体pPIC9K а分泌信号下游,SacⅠ线性化后电转GS115;G418梯度筛选转化菌;PCR鉴定目的基因整合;甲醇诱导表达,SDS-PAGE、Western blotting、肽质量指纹等鉴定表达蛋白.结果成功地对人CTLA4胞外区cDNA进行了定点突变,该突变体在毕赤酵母中能成功表达CTLA4胞外区蛋白.结论为高效表达人CTLA4胞外区蛋白及其功能研究和临床应用奠定了基础.
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CD40及CTLA4模拟小分子肽诱导免疫耐受的实验研究
目的新实验数据显示了CD28-B7和CD40-CD154共刺激信号通路在T细胞活化与效应过程中起重要作用.治疗策略关键在于干扰这些通路,诱导移植物宿主产生免疫耐受.方法我们运用生物信息学和多肽合成技术模拟CTLA4和CD40小分子肽,以阻断这些信号通路.通过MLC、IL-2测定及同源小鼠皮肤移植实验,检测了不同剂量的两种小分子短肽在体内和体外对免疫反应的影响.结果所有治疗组的淋巴细胞增殖降低,IL-2表达低下.在不同水平与时间段,皮肤移植物存活时间显著延长.结论成功模拟CTLA4和CD40小分子肽,该小分子肽能有效地阻断调节T细胞活化的CD28-B7和CD40-CD154分子连接,是潜在的具有临床应用价值的免疫抑制剂.
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CTLA4-EGFP融合蛋白在K562细胞中的表达及其亚细胞定位研究
目的:构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与CTLA4融合蛋白真核表达载体,分析其在K562细胞中的表达和亚细胞定位.方法:以RT-PCR方法克隆人CTLA4基因,构建CTLA4-EGFP融合蛋白的表达载体.以其转染K562细胞后,以流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位.结果:从人外周血细胞中克隆到CTLA4基因的cDNA.通过PCR方法在起始位点前加入Kozak序列并删除终止密码,成功地构建CTLA4-EGFP融合蛋白表达载体.以该质粒转染K562细胞24 h后,CTLA4和EGFP双阳性细胞的百分率为16%.表达的融合蛋白主要分布于胞内,细胞膜上分布较少.相反,转染空载体的细胞仅表达EGFP,且其在细胞内呈弥散样分布.以佛波醇酯加离子霉素刺激后,CTLA4-EGFP融合蛋白在细胞表面表达水平升高到29%,且分布于胞内的融合蛋白向细胞膜靠近并与质膜融合;而转染空载体的细胞内EGFP的分布无明显改变.结论:成功地构建CTLA4-EGFP融合蛋白表达载体,并在K562细胞中得到表达.表达的融合蛋白与天然CTLA4在活化T细胞中的定位和转运特点相似.
