首页 > 文献资料
-
人SMYD3基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达
构建人SMYD3基因原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.通过PCR方法从重组质粒pcDNA-SMYD3中扩增得到SMYD3基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体.将重组质粒转化入E. coli Rosetta(DE3)中,以IPTG诱导融合蛋白表达.表达产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定.酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pGEX-SMYD3.SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明人SMYD3基因在大肠杆菌中获得了良好的表达.实验成功地构建了SMYD3基因原核表达载体并在大肠杆菌中获得良好表达,为进一步研究SMYD3蛋白功能奠定了基础.
-
血小板衍化内皮细胞生长因子原核表达载体的构建
目的构建血小板衍化内皮细胞生长因子(PDECGF)的原核表达载体.方法设计引物扩增PD-ECGF的cDNA,然后亚克隆入原核表达载体pQE和pET-32a,并转化入大肠杆菌JM109.结果通过菌落原位杂交、PCR和重组质粒酶切分析等方法,筛选出重组阳性克隆.结论此重组质粒可用于原核表达等进一步研究.
关键词: 生长因子 血小板衍化内皮细胞生长因子 原核表达载体 -
抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因的克隆及其原核表达载体的构建
目的克隆抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因(VL),并构建其原核表达载体.方法从能分泌抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞BDI-1中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出VL cDNA.用HindⅢ和XhoⅠ酶切纯化的RT-PCR产物和原核表达载体pET28a(+),在T4 DNA连接酶作用下室温连接,重组质粒经酶切鉴定,阳性克隆测序并进行序列分析.结果扩增出VL cDNA片段,大小约为340bp,重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致.VL基因序列长度为324bp,编码108个氨基酸.VL基因属于鼠免疫球蛋白κ轻链Ⅳ亚类.结论成功克隆出抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因,并成功构建其原核表达载体.
-
抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因的克隆及原核表达载体的构建
目的 克隆抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因(VH),并构建其原核表达载体.方法 从能分泌抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞BDI-1中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出VH cDNA,用HindⅢ和XhoⅠ酶切纯化的RT-PCR产物和原核表达载体pET28a(+),在T4 DNA连接酶作用下室温连接.重组质粒经酶切鉴定,阳性克隆测序并进行序列分析.结果 扩增出VH cDNA片段,大小约为370bp,重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致.VH基因序列长度为366bp,编码122个氨基酸.VH基因属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ亚类.结论 成功克隆出抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因,并成功构建其原核表达载体.
-
Tipα基因原核表达质粒的构建及其诱导条件的优化
目的 构建肿瘤坏死因子α诱导蛋白(Tipα)基因的原核表达载体,并优化诱导实验条件使其在大肠杆菌中表达.方法 提取幽门螺杆菌(H pylori) 26695菌株总DNA,用PCR方法扩增位于H.pylori 0596的Tipα基因编码序列.将Tipα基因与pET29a载体同时经BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切、纯化及连接后,构建pET29a-Tipα原核表达质粒,转化至宿主菌Top10F'中.优化实验条件使pET29a-Tipα原核质粒表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot方法进行鉴定.结果 pET29a-Tipα原核表达质粒经双酶切证实插入片段分子量为519 bp DNA条带,测序结果与H.pylori 0596的Tipα基因编码序列相一致.当诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度为1.0 mmol/L,30℃诱导培养4h时,诱导目的蛋白表达量高.Western blot结果证实,表达的重组蛋白可与Tipα抗体产生分子量约为21.8 KD的特异性条带.结论 成功构建了pET29a-Tipα原核表达质粒,并优化实验条件使其在大肠杆菌中表达了Tipα重组蛋白.
关键词: 幽门螺杆菌 肿瘤坏死因子α诱导蛋白 原核表达载体 -
内源性血管生成抑制因子Arresten在E.coli JM109中的表达及抗新生血管生成的药理学研究
目的 构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并进行表达,抑制新生血管的药理学实验中发现,该表达产物具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的功能.方法 从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli JM109进行原核表达,大量表达提取Arresten蛋白,用鸡胚绒毛尿囊膜实验进行活性测定.结果 成功构建的重组质粒pBV220-Arr在E.coli JM109菌株中2~8 h均可获得表达,其中诱导4 h表达效率高,Arresten蛋白可明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长,活性功能明显强于血管抑素.结论 成功构建Arresten基因重组质粒pBV220-Arr,并可在E.coli JM109菌株中获得表达,Arresten蛋白具有明显的抑制血管生成的作用.
关键词: Arresten 原核表达载体 E.coli JM109 基因表达 活性 -
小鼠IL-13Rα2胞外区基因的克隆、表达及鉴定
目的 克隆并在原核表达载体pET-28a中表达小鼠IL-13受体α2(sIL-13Rα2)胞外区基因.方法 利用小鼠3T3细胞总RNA,逆转录为cDNA,设计引物,常规PCR法扩增出小鼠sIL-13Rα2 基因,将PCR产物克隆入pMD18-T载体,经双酶切及测序鉴定后,再亚克隆入pET-28a,构建重组质粒pET-28a/sIL-13Rα2,并转化到大肠杆菌BL21感受态细胞.IPTG 诱导表达后表达产物经Western blot鉴定.结果 PCR扩增产物与预期大小相符合,重组质粒经双酶切鉴定及基因序列测定表明构建正确; sIL-13Rα2 蛋白表达以包涵体形式存在,可与山羊抗小鼠sIL-13Rα2 单克隆抗体发生特异性反应,相对分子质量约为36 ku.结论 成功原核表达sIL-13Rα2基因,为进一步探讨sIL-13Rα2在血吸虫病肝纤维化过程中的调节作用奠定了基础.
关键词: 基因表达 小鼠sIL-13Rα2基因 原核表达载体 -
GFP-Rv2626c融合蛋白表达载体的构建及表达纯化
目的 构建含Rv2626c基因的原核表达载体,获得GFP-Rv2626c融合蛋白,为今后开发鉴别结核感染的血清学诊断试剂打下基础.方法 以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,经PCR法扩增得到Rv2626c基因DNA 片段.将扩增片段克隆到pGM-T载体中测序,并进一步将Rv2626c亚克隆到pET28a-GFP中,构建原核重组表达载体pET28a-GFP-Rv2626c.将pET28a-GFP-Rv2626c转化E.coli BL21(DE3),用IPTG 诱导目的 基因表达,经SDS-PAGE和Western-blot 分析和纯化该表达产物.结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定,成功构建了重组质粒pET28a-GFP-Rv2626c.用IPTG诱导该质粒转化的E.coli BL21后,获得分子量约46kD的GFP-Rv2626c融合蛋白.经Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的GFP-Rv2626c融合蛋白.结论 成功制备出重组GFP-Rv2626c融合蛋白,为开发鉴别结核感染的血清学诊断试剂打下了基础.
-
人幽门螺杆菌VacA与HspA双价候选疫苗抗原的克隆表达及鉴定
目的构建含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)和细胞空泡毒素(VacA)编码基因的重组载体,进行核苷酸序列分析,并在E.coli BL21中表达,研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础.方法利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中,扩增HspA、VacA编码基因片段,将目的基因HspA、VacA与载体pET32a(+)分别进行双酶切后,连接、测序;同时将重组载体pET32a(+)/HspA和pET32a(+)/VacA分别经Xhol、BamHI双酶切,通过凝胶电泳回收pET32a(+)/HspA和VacADNA片段,经T4连接酶将HspA和VacA编码基因通过酶切粘端进行连接,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体,并在大肠杆菌BL21中表达,表达产物经纯化后,以Western blot法检测其抗原性.结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp HspA和VacA编码基因,由1080bp组成,与GenBank报道的相比较,本实验克隆的基因有3.40%的碱基发生变异,导致1.10%的氨基酸残基改变;经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白Mr为59×103,其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103,可溶性表达产物占全菌总蛋白的18.96%;重组蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上;用Western blot法检测显示,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清所识别,具有良好的抗原性.结论成功地克隆并融合表达了Hp HspA和VacA,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制以及快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的基础.
-
减毒沙门氏菌——真核质粒的导入载体
减毒沙门氏菌可侵入到宿主的Peyer氏集结、肠淋巴结、肝、脾等组织细胞,表达异源抗原,不仅激发出宿主针对伤寒杆菌本身的免疫反应,而且激发出针对其所携带抗原的各种免疫反应,包括局部体液免疫、全身体液免疫和细胞免疫反应,尤其是CTL作用。减毒菌本身可起免疫佐剂作用。由于已减毒,终被宿主清除〔1,2〕。减毒沙门氏菌可通过口服或鼻黏膜〔3〕进行接种,因此,接种方式简单,易于大规模的免疫接种。此外,以减毒沙门氏菌为载体的疫苗制备简单、易于储存和运输、抗原不需提纯,所以可显著降低疫苗的制作成本。因此,减毒沙门氏菌是异源抗原免疫的优良载体。但这方面大量的工作都是将异源抗原基因克隆在原核表达载体上,在减毒沙门氏菌原核环境中进行表达。近年来有实验表明,减毒沙门氏菌可将克隆有异源抗原基因的真核表达质粒携带释放入宿主深部淋巴细胞,使异源抗原基因在淋巴细胞的真核环境中进行表达。因此,减毒沙门氏菌有望成为真核质粒的导入载体,成为核酸疫苗的第三种接种方式,且在本质上不同于核酸疫苗的其他两种接种方式,在核酸疫苗研制中具有新的应用前景。
-
幽门螺杆菌融合蛋白UreB-Omp11在大肠杆菌中的表达与纯化
近年来,研究者发现了多种Hp的有效保护性抗原成分,UreB、Omp、Hsp、NAP等,其中尿素酶、外膜蛋白等是人们研究的焦点.但它们单独免疫动物时,获得的免疫保护效果均不理想,为克服单一抗原分子诱导的免疫保护水平偏低的问题,本研究用重叠延伸PCR法将H.pylori郑州分离株MELHP27的ureB与omp11两个基因进行融合,中间加入弹性蛋白连接肽编码序列为接头,并通过设计合适的酶切位点,将融合蛋白插入原核表达载体pMAL-c2X中,使其融合表达,为Hp多价抗原基因工程疫苗的研究奠定基础.
-
结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化
构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化.用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白.PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别.成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白.
-
重组弓形虫GRA4的原核表达与纯化
构建能在pET原核系统中高效表达的弓形虫致密颗粒蛋白GRA4基因的重组表达质粒,并对其表达产物进行纯化.采用PCR方法自pMD1 8-GRA4(pGEX)重组子中扩增GRA4基因片段,定向克隆入原核表达载体pET-23a(+),转化E.coliBL21(DE3),以His·BindTM柱亲和层析纯化表达产物;用此纯化重组蛋白加CFA经皮下注射免疫小鼠三次,间接ELISA法测定其特异性抗体滴度.成功构建了重组表达质粒pET-GRA4,SDS-PAGE显示其表达产物约为40kD,主要以包涵体的形式存在,经亲和纯化后的pET-GRA4重组蛋白产量大、纯度高,能被兔抗弓形虫免疫血清所识别;免疫小鼠后亦可诱导产生出高滴度的特异性IgG抗体.利用pET原核系统成功表达和纯化了弓形虫GRA4重组蛋白,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础.
-
弓形虫致密颗粒蛋白GRA8的原核表达分析
构建弓形虫GRA8的原核重组表达质粒,分析其表达状况.采用PCR技术扩增GRA8及其截短型片段的基因序列,经克隆后,亚克隆至原核表达载体中,构建GRA8及其截短型片段的重组表达质粒,分析GRA8的表达;将各重组菌进行诱导,从其裂解上清中纯化目的蛋白.GRA8基因被正确插入原核表达质粒中;原核重组表达质粒在大肠杆菌中表达GRA8的水平低,几乎无完整GRA8的表达;纯化的截短型GRA8能被弓形虫感染兔血清识别.GRA8的原核重组表达质粒表达GRA8的水平低,纯化的截短型GRA8具有良好的免疫活性.
-
CpG协同Calpain DNA疫苗诱导BALB/c鼠Th1免疫应答和抗日本血吸虫感染
探讨含非甲基化CpG单核苷酸(CpG-ODN)协同Calpain DNA疫苗抗日本血吸虫感染的保护性作用、诱导的免疫应答类型及其免疫机理.Calpain基因从原核表达载体PGEX-2TK亚克隆到含小鼠IL-2基因启动序列的真核表达载体pVAC,构建含日本血吸虫疫苗候选分子Calpain基因的真核表达体系pVAC-calpain的DNA疫苗,构建的DNA疫苗与CpG ODN免疫BALB/c小鼠,在不同阶段采血测定免疫鼠抗体的动态变化、RT-PCR分析免疫鼠细胞因子IFN-γ,IL-4,IL-12的表达,加强免疫一周后用日本血吸虫尾蚴攻击感染免疫鼠,用减虫率、减卵率及其病理组织学指标考核保护性免疫的效果.pVAC-calpain的DNA疫苗体系诱导了IgG抗体的产生,免疫3周后细胞因子IFN-γ,IL-4,IL-12的表达表现出差异.特别是在CpG-ODN和pVAC-calpain免疫组IFN-γ,IL-12有高度表达,而IL-4的表达受到相对抑制,对攻击感染的日本血吸虫表现出了45%的减虫效果,虫卵肉芽肿的面积显著性的减少.CpG ODN协同日本血吸虫Calpain DNA疫苗诱导了Th1为主的免疫应答,并能部分抵抗日本血吸虫感染和减轻感染鼠由于Th2免疫应答所导致的虫卵肉芽肿反应,提示CpG ODN能够协同Calpain DNA疫苗抗日本血吸虫感染和缓解日本血吸虫免疫病理反应.
-
恙虫病东方体Karp株56kDa与47kDa外膜蛋白基因的嵌合和嵌合基因在大肠杆菌的表达
将恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株的56kDa和47kDa外膜蛋白基因嵌合,并使嵌合基因在大肠杆菌细胞内表达,产生双抗原融合蛋白.采用PCR方法,从Ot Karp株基因组DNA中扩增56kDa蛋白基因片段,将该片段分别与原核表达载体pQE30及47kD蛋白基因重组质粒pQE30/47连接,构建pQE30/56及pQE30/56-47重组质粒;用IPTG诱导转入大肠杆菌内的重组质粒的目的基因表达.SDS-PAGE显示,pQE30/56转化的大肠杆菌产生一约50kDa的融合蛋白和pQE30/56-47转化大肠杆菌产生一约90kDa融合蛋白(56-47融合蛋白),免疫印迹分析显示两融合蛋白均与OtKarp株感染鼠血清产生特异性反应,56-47融合蛋白分别与47kDa、56kDa重组蛋白免疫的小鼠血清产生特异性反应,以及56-47融合蛋白免疫血清与56kDa和47kDa重组蛋白反应.Ot Karp株的56kDa与47kDa外膜蛋白基因嵌合后在大肠杆菌细胞内实现了表达,表达的融合蛋白具有56kDa和47kDa外膜蛋白的抗原特性.
-
贝氏柯克斯体30kDa外膜蛋白基因表达及重组外膜蛋白免疫保护性的研究
研制贝氏柯克斯体30kDa重组外膜蛋白和分析该重组蛋白的免疫保护作用.将克隆贝氏柯克斯体30kDa外膜蛋白基因与原核表达载体pQE30重组,用重组质粒转化大肠杆菌后用IPTG诱导转化菌表达重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫小鼠2次,用IFA和ELISA检查免疫小鼠的特异性抗体,以及用重组蛋白体外刺激小鼠T淋巴细胞增殖;免疫4周后,用柯克斯体毒株攻击免疫小鼠,攻毒后第7d,小鼠的主要脏器作病理学检查和柯克斯体量测定.(1)贝氏柯克斯体30kDa外膜蛋白基因在大肠杆菌细胞内表达,产生的重组蛋白约占全菌蛋白的14.6%,免疫印迹显示该重组蛋白能与贝氏柯克斯体感染小鼠血清反应.(2)ELISA检测出免疫小鼠血清中有高滴度的抗重组外膜蛋白抗体,免疫小鼠的脾淋巴细胞经重组外膜蛋白刺激后,细胞增殖水平显著高于非免疫小鼠.(3)免疫小鼠的肺、肝、脾,无明显病变,仅个别小鼠脾脏存在少量柯克斯体,而非免疫小鼠的肺、肝、脾病变十分明显,脾脏明显肿大并含有大量的柯克斯体.贝氏柯克斯30kDa重组外膜蛋白诱导小鼠产生抗贝氏柯克斯体的体液和细胞免疫应答能有效地抵御贝氏柯克斯体的感染.
-
贝氏柯克斯体表面抗原基因p1与hspB的融合基因在大肠杆菌中的表达
将贝氏柯克斯体(Coxiella burneil)表面抗原P1蛋白基因与热休克蛋白B(HspB)基因片段融合,并使该融合基因在大肠杆菌细胞内表达,产生P1-HspB融合蛋白.采用PCR方法,从贝氏柯克斯体新桥株基因组DNA中扩增P1蛋白基因(p1)和HspB蛋白基因(hspB)片段,将两基因片段分别与原核表达载体pQE30连接,分别构建重组表达质粒pQE30/p1和pQE30/hspB.用BamHⅠ和SadI DNA内切酶将p1基因片段从pQE30/p1切下并与pQE30/hspB的hspB连接,构建重组质粒pQE30/p1-hspB.用IPTG诱导pQE30/p1-hspB转化的大肠杆菌表达融合基因p1-hspB.SDS-PAGE分析发现pQE30/p1-hspB转化的大肠杆菌表达一83 kDa融合蛋白;经薄层扫描分析,该融合蛋白约占到全菌体蛋白的12.1%;免疫印迹分析发现该融合蛋白能被贝氏柯克斯体感染小鼠血清所识别.构建的p1-hspB融合基因在大肠杆菌中得到了有效表达,表达的P1-HspB融合蛋白能与抗贝氏柯克斯体抗体特异反应,P1-HspB融合蛋白为Q热亚单位疫苗的研制提供了一种新型融合蛋白.
-
立氏立克次体外膜蛋白B基因片段的克隆与表达
采用PCR方法,从立氏立克次体基因组中扩增长为1188bp的ompB基因片段,将该基因片段与原核表达载体pQE30连接,构建重组原核表达质粒pQE30/ompB;将pQE30/ompB转入大肠杆菌细胞内,用IPTG诱导转化大肠杆菌表达目的基因.SDS-PAGE分析发现pQE30/ompB转化菌表达了一44kDa重组蛋白,该蛋白与立氏立克次体免疫兔血清在免疫印迹分析中呈阳性反应,与其它立克次体免疫血清反应呈阴性,用该重组蛋白免疫血清做间接免疫荧光,检测立氏立克次体结果为阳性,而检测贝氏柯克斯体、恙虫病立克次体和普氏立克次体的结果为阴性.本研究证明pQE30/ompB转化的大肠杆菌表达了ompB基因片段,所产生的重组蛋白具有立氏立克次体抗原特异性和良好的免疫反应性.
-
恙虫病东方体58kDa热休克蛋白与47kDa外膜蛋白的基因嵌合及58-47嵌合基因在大肠杆菌中表达
采用PCR方法,从恙虫病东方体Karp株基因组DNA中扩增58kDa热休克蛋白的基因,将该基因分别与原核表达载体pQE30及47kDa外膜蛋白的基因重组质粒(pQE30/47)连接,构建pQE30/58及pQE30/58-47重组质粒,用重组质粒转化大肠杆菌.SDS-PAGE显示,pQE30/58和pQE30/58-47转化的大肠杆菌分别产生一58kDa重组蛋白和一90kDa的双抗原(58-47)融合蛋白.免疫印迹分析显示Karp株免疫血清能特异识别58kDa重组蛋白和90kDa融合蛋白,90kDa融合蛋白既与47kDa重组蛋白也与58kDa重组蛋白的免疫血清特异反应,58kDa与47kDa重组蛋白也被90kDa融合蛋白免疫血清所识别.研究结果证明58-47融合蛋白具有恙虫病东方体Karp株47kDa外膜蛋白和58kDa热休克蛋白的抗原特性.