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小鼠胆盐依赖脂肪酶蛋白原核表达载体的构建与蛋白制备
目的 构建小鼠胆盐依赖脂肪酶(BSDL)重组蛋白的大肠埃希菌原核表达载体,制备具有生物学活性的小鼠BSDL蛋白.方法 首先应用PCR合成mBSDL的cDNA序列,克隆至原核表达载体pET-28b,转化大肠埃希菌表达菌种BL21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达.使用His Trap FF crude柱纯化重组mBSDL蛋白.Western blot鉴定后采用尿素浓度梯度降低法进行透析复性.结果 成功构建原核表达载体pET-28b-mBSDL,实现该蛋白在E.coli BL21 (DE3)表达菌种中的高效表达,并且表达蛋白主要存在于包涵体中.Western blot示获得较好的纯化效果且纯化后成功复性.结论 成功构建mBSDL基因的原核表达质粒并制备具有活性功能的胆盐依赖脂肪酶,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.
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胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合肽与肿瘤坏死因子的融合与鉴定
目的 将胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合肽pd20与人肿瘤坏死因子α(TNF-α)进行基因融合,并构建原核表达载体,表达pd20-TNF-α融合蛋白.方法 利用全基因合成法制备pd20-TNF-α融合基因,构建pd20-TNF-α原核表达载体,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达.对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot 检测分析.结果 成功构建了pd20-TNF-α重组融合质粒,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在相对分子质量约21000处出现了1条新生的蛋白条带,转印NC膜后该融合蛋白可与抗TNF-α单克隆抗体特异性结合.结论 成功构建了pd20-TNF-α基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行诱导表达,为下一步融合蛋白的纯化奠定了实验基础.
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北柴胡糖基转移酶基因BcUGT8的克隆、序列分析及其原核表达载体构建
目的 克隆北柴胡Bupleurum chinense中可能参与柴胡皂苷生物合成的糖基转移酶基因BcUGT8,构建其原核表达载体,为通过体外表达和纯化蛋白的催化活性,分析验证其功能奠定基础.方法 在Roche (454) GS FLX系统高通量测序已获得部分cDNA序列基础上,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)和长距离PCR扩增方法(LD-PCR)克隆全长cDNA.设计含有酶切位点的PCR引物,PCR扩增其开放阅读框(ORF),酶切后,插入到pET-28a(+)载体中,构建出原核表达载体.结果 扩增到北柴胡1个糖基转移酶(UGT)基因全长cDNA,构建了这一基因的原核表达载体.结论 通过BcUGT8基因的全长cDNA克隆、序列分析和原核表达载体的构建,为后续开展体外酶蛋白表达、纯化和催化活性分析实验,验证其生物功能奠定了基础.
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布渣叶查耳酮合酶基因全长cDNA克隆及其表达模式分析
目的 克隆布渣叶查耳酮合酶基因(MpCHS)全长cDNA,并对其在不同部位和不同生长阶段叶片中的表达模式进行分析.方法 以布渣叶叶片总RNA逆转录合成cDNA为模板,根据其转录组数据设计特异引物序列,PCR扩增MpCHS基因全长cDNA,经质粒连接、转化、扩培,挑选阳性克隆测序、分析并构建原核表达载体.同时,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对MpCHS基因的表达模式进行分析.结果 成功克隆得到MpCHS基因全长cDNA (GenBank:KY472608).生物信息学分析表明其开放阅读框为1 176bp,编码含391个氨基酸的蛋白,其相对分子质量为42 700,理论等电点6.11,具有CHS家族蛋白3个保守的功能活性位点(165 C、304 H和337N)和特征多肽标签序列RLMMYQQGCFAGGTVLR和GVLFGFGPGL.系统进化树分析发现MpCHS与可可、陆地棉等木本植物的亲缘关系比较近.RT-qPCR结果表明,MpCHS基因在不同部位均有表达,在叶片中的表达量随着生长过程逐步降低.结论 首次克隆得到MpCHS基因,并分析了MpCHS基因在布渣叶不同部位和不同生长阶段叶片中的表达模式,为MpCHS基因的原核表达和功能验证奠定了基础,也为进一步解析布渣叶黄酮类生物合成途径提供了参考.
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PTD-BCR/ABL-OD融合癌蛋白的表达和跨膜转运
寡聚化结构域(oligomerization domain,OD)是BCR/ABL融合蛋白N端的一个重要结构域,是2个单体通过N末端螺旋易位,然后在C末端螺旋间形成反向卷曲折叠形成二聚体,进而互相叠套形成四聚体.在几种不同类型的Ph染色体阳性的慢性粒细胞白血病(CML)患者中可以观察到这种四聚体的形成,它能介导BCR/ABL融合蛋白多聚体的形成,进而使无活性的ABL蛋白的酪氨酸激酶活化[1,2].因此,如果能够利用外源性的OD结构域蛋白干预内源性蛋白的聚合,从而达到抑制BCR/ABL蛋白激酶活化的作用.我们在以前工作的基础上,采用PCR扩增OD区基因片段,并在其N端融合蛋白转导结构域(PTD)基因后,构建原核表达载体,然后在大肠杆菌中进行表达.纯化表达的融合蛋白,并加入到培养的K562细胞中,对OD结构域蛋白在细胞中的作用进行了初步探讨.
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甲状腺球蛋白抗原决定簇基因的克隆及原核表达载体的构建
目的:扩增甲状腺球蛋白抗原决定簇基因,构建可转化入大肠杆菌的重组表达载体.方法:用TRIzol一步法从甲状腺组织中提取总RNA,RT-PCR逆转录出cDNA,PCR扩增出目的基因,与pET102/D-TOPO载体进行拓扑克隆,对重组质粒进行PCR、酶切及测序鉴定.结果:甲状腺球蛋白抗原决定簇基因及其重组表达载体经鉴定准确无误.结论:成功构建了带有目的基因的原核表达载体.
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人血管生成素-1基因的克隆及表达载体的构建
[目的]克隆人血管生成素-1基因,并构建原核、真核表达载体.[方法]提取人骨髓中的总RNA,反转录成cDNA,利用巢式PCR技术扩出人血管生成素-1基因片段,并克隆到PQE-31、B7载体中.[结果]克隆了正确的人血管生成素-1基因,构建了PQE31Ang-1、B7Ang-1载体.[结论]人血管生成素-1基因的克隆及表达载体的构建,为进一步研究其功能、活性和应用奠定了基础.
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核心蛋白聚糖原核表达体系的构建
目的通过克隆核心蛋白聚糖(decorin,DCN)基因,构建原核表达体系并表达DCN蛋白.方法利用特异引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增编码DCN分子的外显子序列,与表达载体pET-21a(+)重组,构建原核表达体系pET-21a(+)-DCN的重组质粒.经双酶切、测序鉴定基因序列,将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中,用IPTG 37℃诱导获得DCN融合蛋白.结果克隆了hDCN基因,成功构建了pET-21a(+)-DCN重组质粒,获得了稳定的pET-21a(+)-DCN原核表达体系,并得到了纯化的融合蛋白.结论建立了pET-21a(+)-DCN稳定的原核表达体系,表达并纯化了DCN.
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小鼠PRL-3原核表达载体的构建
目的:构建小鼠PRL-3基因的原核表达载体,并在感受态细菌BL21中表达.方法:提取小鼠黑色素瘤B16F10细胞的总RNA,经RT-PCR扩增小鼠PRL-3基因,并将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,阳性克隆经限制性内切酶BamHI、EcoRI酶解及测序鉴定后,转化感受态细菌BL21,经IPTG诱导表达GST-mPRL-3融合蛋白.结果:获得全长为522 bp的小鼠PRL-3基因片段,构建重组质粒pGEX 4T-1 mPRL-3,转化感受态细菌BL21后,经IPTG诱导,表达出分子质量约为46KD的GST-mPRL-3蛋白.SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以可溶性形式存在于E.coli BL21的胞质中.结论:成功地构建了原核表达载体pGEX-4T-1-mPRL-3,为抗体的制备筛选和肿瘤的相关研究奠定了实验基础.
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鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化
目的:克隆小鼠HMGB1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化获得His-HMGB1的融合蛋白.方法:脂多糖刺激后的RAW264.7细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增出含HMGB1的目的片段,克隆于pMD-19T载体,再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后行SDS-PAGE鉴定目标蛋白表达,用镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化含His-标签肽的目的蛋白.结果:经PCR扩增出大小为648 bp的HMGB1基因片段,成功构建目标蛋白的融合表达载体,经诱导表达及分离纯化,获得了约30 kD的融合蛋白.结论:构建HMGB1的融合表达载体,获得分离纯化融合蛋白His-HMGB1,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.
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羊布鲁氏菌omp25基因原核表达载体的构建与鉴定
目的:利用PCR反应从羊布鲁氏菌基因组DNA中克隆omp25基因,并将其构建到原核表达载体pET -32a中.方法:试剂盒法提取羊布鲁氏菌基因组DNA,设计合适的引物,通过PCR反应从基因组中扩增外膜蛋白OMP25的编码基因(omp25).将得到的基因片段连接到克隆载体pMD19 -T的多克隆位点(MCS)中,将连接体pMD19 -T - omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析与序列测定.利用酶切与连接反应将目的基因( omp25)插入载体pET -32a的多克隆位点中,将连接体pET -32a -omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析.结果:PCR扩增得到的基因片段与GenBank中已公布的羊布鲁氏菌omp25基因同源性为99％.酶切分析结果表明,omp25基因成功地插入载体pET -32a中.结论:成功地扩增得到了羊布鲁氏菌omp25基因并构建了携带该基因的重组原核表达载体pET-32a-omp25,为后续的研究提供了可靠的基础.
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人成纤维细胞生长因子7的基因克隆和蛋白鉴定
目的:构建人成纤维细胞生长因子7的重组原核表达质粒pGEX-4T-3-FGF7,并诱导其基因在大肠杆菌DH5α中大量表达,纯化蛋白并检验生物学活性.方法:实验于2006-12在本实验室完成.采用逆转录-聚合酶链反应技术,从人皮肤成纤维细胞内扩增编码人成纤维细胞生长因子7的cDNA序列,以DNA重组技术将获得的目的基因片段连接至原核表达载体pGEX-4T-3上,经抗生素筛选挑取阳性克隆扩增后,提取DNA进行酶切鉴定和测序.同时应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹方法对其表达产物进行特异性鉴定.超滤纯化蛋白后以四甲基偶氮唑盐法测定其在不同浓度作用下对人表皮角化细胞系生长的影响.结果:克隆出的成纤维细胞生长因子7基因的cDNA包括翻译起始密码子、编码序列和终止密码子等部分,含有成纤维细胞生长因子7基因的cDNA的表达质粒pGEX-4T-3-hFGF7在DH5α细菌体内能够表达,并且随着诱导时间的延长,成纤维细胞生长因子7基因的表达量增加,重组人成纤维细胞生长因子7蛋白主要存在于包涵体中.在所测浓度范围内该蛋白可以剂量依赖模式促进人表皮角化细胞系细胞在体外分裂增殖.结论:人成纤维细胞生长因子7基因可以在原核细胞中获得表达并具有促角质细胞增殖的生物活性,为深入研究该蛋白在皮肤创伤愈合中的具体作用奠定了基础.
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人乳头瘤病毒16型E7基因原核表达载体的构建及表达
目的:构建人乳头瘤病毒16型(HPV-16)E7基因原核表达载体,观察目的基因的蛋白表达.方法:人工合成HPV16 E7基因核苷酸序列,利用特异性引物通过聚合酶链反应扩增HPV16 E7基因,并克隆至pGEX-4T1原核表达载体,构建重组表达载体pGEX-4T1-HPV16-E7.将其转化到工程菌Rosetta后,经IPTG诱导表达,进行E7-GST融合蛋白的SDS-PAGE分析和Ni2+-NTA亲和层析纯化.结果:E7基因PCR扩增产物和重组表达质粒的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳,均可见300 bp的目的基因条带.表达的重组蛋白经SDSPAGE电泳和纯化后,在相对分子质量约36 000处有特异性表达带,与预期相符.结论:在原核系统中含E7基因的重组质粒可有效表达E7-GST融合蛋白.
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NCTC11637外膜蛋白36ku基因的克隆及序列分析
目的:对人幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H. pylori)36ku(OMP36)外膜蛋白进行基因克隆表达,探索研制H.pylori疫苗的新途径.方法:培养H. pylori菌株NCTC11637,采用酚:氯仿抽提和纯化基因组DNA.设计上下游引物,并以该基因组为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因片断.将目的基因和PET32a(+)同时经Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ双酶切,纯化,连接后,转化含有目的基因的重组载体,酶切鉴定后进行序列分析.结果:经酶切,测序分析表明,插入的基因片断为987bp,与GenBank公布的H.pylori 26695、ATCC43504及J99序列相比较,同源性高达94%-96%,推测的氨基酸序列同源性为97%-99%,GenBank登录号059968.结论:成功克隆了H.pylori36ku的外膜蛋白的编码基因,其表达产物OMP36有望成为新的Hp疫苗候选分子,为H.pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了基础.
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金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆及表达
目的对金黄色葡萄球菌肠毒素A基因(SEA)进行克隆、鉴定与表达,为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究SEA的功能奠定基础.方法用聚合酶链反应(PCR)扩增SEA基因,将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T上,经测序反应确定无误,酶切后将SEA基因与原核表达载体pET42b(+)构建表达SEA的重组质粒,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,经双酶切鉴定后,再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内,对转化菌株进行诱导后,破菌,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE).结果构建了表达载体pET42b(+)-SEA,并获得高效表达,表达的蛋白质相对分子质量为27 000,重组蛋白(rSEA)在37 ℃、25℃经异丙基硫化-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导时均以包涵体形式存在.结论 SEA基因成功克隆到表达质粒内并表达,为制备单抗、诊断试剂及其致病机制研究奠定了基础.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素A 原核表达载体 克隆 表达 -
副溶血弧菌TDH基因的克隆与表达
目的对副溶血弧菌TDH基因进行克隆、鉴定与表达,为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究TDH的功能奠定基础.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增TDH基因将扩增的产物连接于测序载体pGEM-T上,经测序反应确定无误后,再将PCR产物与原核表达载体pQE100构建表达TDH的重组质粒,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,经双酶切鉴定后,再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内,对转化菌株进行诱导后,破菌,进行SDS-PAGE电泳.结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白,其表达的蛋白质相对分子质量为24 000.结论 TDH基因成功克隆到表达质粒内并表达,为制备单抗、诊断试剂与其致病机制研究奠定了基础.
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结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达
目的对结核分枝杆菌的ESAT-6基因进行克隆、鉴定与表达,为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础.方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)对ESAT-6基因进行扩增,将扩增的产物连接于测序载体pGEM-T上,经测序反应确定无误后,再将PCR产物与原核表达载体pET42b(+)构建表达ESAT-6的重组质粒,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,经酶切鉴定后,再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内,对转化菌株进行诱导后,破菌,进行SDS-PAGE电泳.结果电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白,其表达的蛋白质相对分子质量为9 900.结论目的基因克隆到菌株内,重组结核分枝杆菌ESAT-6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础.
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人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定
目的 构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白.方法 利用限制性内切酶EcoR I和Sal I将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定.选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm.经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误.在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别.结论 成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm.大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础.
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水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E原核表达载体的表达及产物纯化
目的:构建水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E(gE)原核表达系统的纯化方法,并鉴定目的蛋白.方法:将VZV gE基因片段克隆到原核表达载体pGEX-1λT,构建重组原核融合蛋白表达载体pGEX-VZVgE;用IPTG(异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷)诱导融合蛋白在大肠杆菌中表达;利用蛋白回收试剂盒对表达产物进行纯化.并用免疫印迹法检测纯化产物的抗原性.结果:经双酶切及测序鉴定所得到的重组质粒即为含有目的片段的重组载体pGEX-VZVgE;在IPTG诱导下pGEX-VZVgE表达分子质量为98 ku的融合蛋白;纯化后的融合蛋白经凝血酶酶切后,得到分子质量约为72 ku的VZV gE,并用免疫印迹证明其具有良好的抗原性.结论:构建的VZV gE重组原核表达载体能表达重组蛋白,并建立了一套纯化VZV gE的方法;从而为VZVgE的应用研究打下基础.
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沙眼衣原体E型MOMP基因原核表达载体的构建和纯化
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)共有19个血清型,其中D～K血清型则可通过性传播,引起人类泌尿生殖道感染,并可引起并发症.沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)携带Ct亚型等多种抗原决定簇,是诊断试剂和疫苗开发的基础.本研究选择MOMP基因作为研究对象,用PCR技术扩增E型沙眼衣原体MOMP基因片段,再将其定位插入到原核表达载体pGEX中,构建重组表达质粒.然后将重组表达质粒转化人大肠杆菌(BL-21)中,并用酶切分析、PCR扩增及部分序列测定等方法对重组质粒进行鉴定.诱导表达,用SDS-PAGE及蛋白印迹进行鉴定,并以亲和层析柱纯化表达产物,为进一步研究该蛋白的生物学特性,了解衣原体的致病机制奠定基础.
