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布鲁氏菌OMP25的表达、纯化、鉴定及多克隆抗体的制备
目的 表达和纯化布鲁氏菌OMP25重组蛋白并制备OMP25多克隆抗体,为建立布鲁氏菌病的诊断方法奠定基础. 方法 采用PCR方法扩增M16羊布鲁氏菌标准菌株的OMP25外膜蛋白基因,连接载体质粒pET-30a(+)并导入受体细胞DH5α中,构建重组PET-30a(+)-OMP25质粒,转化至Rosetta(DE3)菌株,收集表达的蛋白,用Ni2+NTA柱纯化试剂盒进行纯化.用纯化的重组蛋白免疫家兔,制备OMP25多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性.结果 成功构建重组质粒PET-30a(+)-OMP25,导入受体细胞Rosetta (DE3),获得重组蛋白,纯化后免疫家兔,制备的OMP25多克隆抗体与OMP25重组蛋白发生特异性反应. 结论 成功构建重组质粒PET-30a(+)-OMP25,表达的重组蛋白具有免疫原性,并制备了高纯度、高效价的多克隆抗体,为布病免疫诊断方法的建立奠定了基础.
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羊布鲁氏菌omp25基因原核表达载体的构建与鉴定
目的:利用PCR反应从羊布鲁氏菌基因组DNA中克隆omp25基因,并将其构建到原核表达载体pET -32a中.方法:试剂盒法提取羊布鲁氏菌基因组DNA,设计合适的引物,通过PCR反应从基因组中扩增外膜蛋白OMP25的编码基因(omp25).将得到的基因片段连接到克隆载体pMD19 -T的多克隆位点(MCS)中,将连接体pMD19 -T - omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析与序列测定.利用酶切与连接反应将目的基因( omp25)插入载体pET -32a的多克隆位点中,将连接体pET -32a -omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析.结果:PCR扩增得到的基因片段与GenBank中已公布的羊布鲁氏菌omp25基因同源性为99％.酶切分析结果表明,omp25基因成功地插入载体pET -32a中.结论:成功地扩增得到了羊布鲁氏菌omp25基因并构建了携带该基因的重组原核表达载体pET-32a-omp25,为后续的研究提供了可靠的基础.
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羊种布鲁菌omp25的原核表达与免疫原性检测
目的 在大肠杆菌中表达羊种布鲁菌omp25基因并鉴定重组蛋白的免疫原性.方法 从羊种布鲁菌中用聚合酶链反应技术(PCR)扩增得到布鲁菌omp25基因片段,并将目的 基因插入原核表达载体PET-32a中,构建重组质粒PET-32a/omp25转入大肠杆菌E.coli Rosetta中并进行诱导表达,用SDS-PAGE和western-blot检测表达蛋白.结果 成功构建了重组质粒PET-32a/omp25,并在大肠杆菌Rosetta中获得了重组蛋白,重组蛋白与布鲁菌阳性血清发生特异性反应.结论 重组质粒PET-32a/omp25可以在大肠杆菌Rosetta中成功表达,并且重组蛋白可与布鲁菌阳性血清发生特异性反应,说明该重组蛋白有良好的免疫原性,该研究为疫苗的研制及布鲁菌病的检测打下良好的基础.
