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普氏立克次体120 kDa表面抗原N端和C端基因的克隆与表达
采用PCR方法,从普氏立克次体基因组中扩增出120kDa表面抗原的N端和C端基因片断,并将其克隆于原核表达载体pQE30,构建重组质粒pQE30/N和pQE30/C,将重组质粒转入大肠杆菌M1 5,用IPTG诱导大肠杆菌内的目的基因表达.SDS-PAGE分析发现两重组质粒转化菌分别产生了一26kDa(N端)和67kDa(C端)重组蛋白;在免疫印迹分析中,26kDa和67kDa重组蛋白均与普氏立克次体免疫血清发生特异反应,证明27kDa和67kDa重组蛋白分别为120kDa表面抗原的N端和C端重组蛋白,具有普氏立克次体120kDa表面抗原特性.
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穿膜肽-TDRG1重组蛋白原核表达载体的构建
构建穿膜肽TAT与TDRG1融合蛋白的原核表达载体.以pYD5-TDRG1载体为模板,设计N端和C端含有flag序列和不同酶切位点的引物,利用PCR技术扩增TDRG1基因片段.同时利用内切酶对已构建好的载体pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT进行酶切处理,再把扩增产物插入已处理好的线性载体pET28a(含有TAT)中,构建成重组质粒pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT,热激转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选,送测序比对验证.PCR扩增出TDRG1基因片段,目的插入片段长约344bp,产物行限制性内切酶酶切后连接到预先酶切处理好的线性载体pET28a上,并成功转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选后挑选阳性克隆抽质粒送测序,测序比对序列完全一致.成功构建了原核表达载体pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT.
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GST-CTCF 融合蛋白原核表达载体的构建及表达
目的：构建人 CCCTC 结合因子（CCCTC-binding factor，CTCF）与谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transfer-ase，GST）重组蛋白的原核表达载体，并进行诱导表达。方法以 pEASY-T1-SIMPLE-CTCF 为模板，设计引入限制性酶切位点的 CTCF 引物，PCR 方法扩增目的片段，产物经限制性内切酶酶切后与原核表达载体 pGEX-4T-1连接，构建成 pGEX-4T-1-CTCF 原核表达载体，转化至大肠埃希菌 BL21中，经异丙基硫代-β-D 半乳糖苷（IPTG）进行诱导，Western blot 检测 GST-CTCF 融合蛋白的表达情况。结果经菌液 PCR、质粒双酶切分析、基因测序分析证实重组表达质粒 pGEX-4T-1-CTCF 构建成功，GST-CTCF 融合蛋白产物经 Western blot 鉴定为特异性表达。结论成功构建了 pGEX-4T-1-CTCF 原核表达质粒，获得特异性的 GST-CTCF 融合蛋白，为进一步研究转录因子CTCF 的功能奠定了基础。
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猪干扰素-γcDNA的克隆和原核表达
目的 克隆猪的干扰素-γcDNA,并进行原核表达,以实现猪干扰素-γ的大量生产.方法 收集转染细胞(CHO-PCI-neo-PoIFNγ),用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取总RNA,并通过RT-PCR的方法扩增获得猪干扰素-γcDNA基因.将获得的猪干扰素-γcDNA基因克隆入原核表达载体pBV220中,组装成原核表达载体pBV220-cPoIFNγ.将这个表达载体转化入大肠杆菌表达菌株DH5α和BL21中,温度诱导培养后,进行SDS-PAGE实验检测.结果 特异表达带约在17KD的位置,并证实在菌株DH5α和BL21中的表达量没有明显的差异,其表达量都约占细菌总蛋白的15%.结论 成功地进行了猪的干扰素-γcDNA,并进行原核表达,为猪干扰素-γ的大量生产提供了可能.
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Heymann肾炎RAP全长及氨基端融合蛋白表达载体的构建及表达
目的 构建大鼠Heymann肾炎致病源RAP全长和氨基端多肽原核融合表达载体,表达并纯化融合蛋白.方法 采用RT-PCR法获得RAP全长的cDNA,将其与pGEM-T克隆载体连接并转化,筛选阳性克隆测序;设计针对RAP全长和氨基端的引物进行PCR扩增,获得相应的DNA.纯化后与PGEX-4T-1载体连接,亚克隆到感受态细菌BL21中,经IPTG诱导,表达融合蛋白并纯化,经SDS-PAGE和Western Blot检验.结果 酶切分析、PCR及DNA序列测定结果表明成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1-RAP1083/258,并表达出RAP全长70kD和氨基端36kD的融合蛋白.Western Blot结果显示分别在70、36 kD处出现特异性条带,与理论相符.结论 RAP1083/258与pGEX-4T-1融合基因表达载体的成功构建及其融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,为后续研究RAP不同区段在Heymann肾炎发病机制中的作用奠定了基础.
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sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定
目的 采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白.方法 从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长CDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定.通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定.结果 获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白.此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29 000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别.经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性.结论 人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性.
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人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定
目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。
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人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建
目的:构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达.方法:用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoR I酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JMl09,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoR I酶切获取目的片段,并与EcoR I酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落.基因测序并用Omega 2.0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性.通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量.结果:PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98.73%,氨基酸序列同源性为99.68%.Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28.4%.结论:成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达.
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多聚嘧啶序列结合蛋白的表达、纯化及其与HBV转录后调节元件RNA结合的分析
目的 在大肠埃希菌中表达并纯化多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein,PTB)-His融合蛋白,并鉴定PTB与HBV转录后调节元件(HBV posttranscriptional regulatory element,HPRE) RNA的体外结合.方法 构建PTB-His融合蛋白的原核表达载体,经IPTG诱导表达后,用亲和层析的方法进行纯化.用磁珠结合与Western 印迹的方法,验证PTB与HPRE RNA在体外的特异性结合.结果 成功构建了PTB-His融合蛋白的原核表达载体,并在体外大量表达后用亲和层析的方法得到了高纯度的PTB-His融合蛋白.磁珠结合沉淀与Western 印迹实验证明PTB与HPRE RNA在体外能特异性的结合.结论 体外表达的PTB融合蛋白能与HPRE RNA特异性的结合.
关键词： HBV转录后调节元件 多聚嘧啶序列结合蛋白 原核表达载体 -
猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的克隆及高效表达
本试验参照GenBank公布的Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)VR2332株的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,应用RT-PCR方法扩增出了PRRSV的核衣壳蛋白基因(N基因).在对N基因及pET32a载体双酶切后进行连接,构建了高效原核表达载体pETN.将pETN重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌后,对培养条件及诱导表达条件(IPTG佳浓度、作用时间)等影响表达的因素进行优化,实现了PRRSV核衣壳蛋白基因的高效表达.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 核衣壳蛋白基因 扩增 原核表达载体 -
人血管生成素2原核表达载体的构建及鉴定
目的 构建人血管生成素2( Angiopoietin2)原核表达载体.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增获取Angiopoietin2基因片段,然后将其克隆入pET32a质粒载体表达系统,实现Angiopoietin2在大肠杆菌BL21中的稳定表达,并通过凝胶电泳、SDS-PAGE及基因测序等对表达蛋白进行鉴定.结果 从HUVEC中克隆出约1.5kb的Angiopoietin2基因,通过pET32a载体系统实现了Angiopoietin2蛋白的表达,SDS-PAGE、电泳及测序分析证实表达成功,融合蛋白相对分子质量为70×103.结论 应用基因重组技术成功构建了人Angiopoietin2原核表达载体.
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人髓样细胞触发受体-1原核表达载体的构建和表达及多克隆抗体的制备
目的 构建人髓样细胞触发受体-1(TREM-1)原核表达载体使其表达并制备多克隆抗体。方法 采用特异性引物扩增人TREM-1胞外段cDNA,经酶切、连接、构建到原核表达载体pET28a(+),将构建的重组表达质粒转化入E.coli BL21( DE3)菌株,采用IPTG诱导表达、Ni-NTA 柱亲和层析纯化目的蛋白、SDS-PAGE分析蛋白纯度,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果 序列测定证实构建的重组表达载体pET28a(+)-TREM-1含有人TREM-1编码序列,其序列分析与Genbank中公布序列对比一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为21.80 kDa的目的蛋白,SDS-PAGE分析表明纯化后的目的蛋白达到电泳纯,双向琼脂扩散法检测抗体效价为1:16,ELISA法检测抗体效价为1:25 600,Western blot分析显示抗体能特性结合人TREM-1重组蛋白。结论 成功构建高表达重组人TREM-1蛋白的原核表达载体及制备高效价兔抗人TREM-1多克隆抗体。
关键词： 人髓样细胞触发受体-1 原核表达载体 脓毒症 多克隆抗体 -
人瘦素蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化
目的构建人瘦素因子(Leptin)的原核表达质粒pGEX-4T-3-LEP,并诱导该基因在原核细胞中大量表达.方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和DNA重组技术,从人皮肤成纤维细胞内将编码人Leptin的cDNA序列克隆至原核表达载体pGEX-4T-3上,选取阳性克隆扩增后,提取DNA进行酶切鉴定和测序.同时应用SDS-PAGE和蛋白质印迹方法对其表达产物进行特异性鉴定.结果克隆出的Leptin基因的cDNA由469bp组成,包括翻译起始密码子、编码序列和终止密码子等部分,含有Letinp基因的cDNA的表达质粒pGEX-4T-3在DH5α细菌体内能够表达,并且随着诱导时间的延长,Leptin基因的表达量增加,重组Leptin蛋白主要存在于包涵体中.结论Leptin基因可以在原核细胞中获得表达,为深入研究该蛋白在创伤愈合中的具体作用奠定了基础.
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血管生成抑制因子Arresten基因对裸鼠移植瘤的研究
Arresten是新发现的一种强有效血管生成抑制因子,是Ⅳ型胶原α1链的羧基末端NC1结构域多肽片段;它能有效抑制新生血管形成及肿瘤的生长和转移[1].近,我们采用RT-PCR方法和基因重组技术,已成功地完成了人arresten基因的分子克隆与序列测定[2].并已构建arresten基因的原核表达载体,且在大肠杆菌中进行了表达,在此基础上,我们拟构建arresten基因的真核表达载体,并观察体内转染质粒DNA-脂质体复合物的方法对裸鼠移植瘤的影响.
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胶质纤维酸性蛋白的原核表达、纯化及鉴定
目的 为获得高纯度的人胶质纤维酸性蛋白(GFAP).方法 从人脑胶质瘤组织中提取mRNA,采用RT-PCR的方法克隆GFAP基因全长序列,利用限制性内切酶EcoR I和Xho I将GFAP基因插入到原核表达载体pGEX4T2,对重组表达载体pGEX4T2-GFAP进行双酶切和测序鉴定.选择测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫酸代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达GFAP-GST融合蛋白.经亲和层析纯化获得GFAP融合蛋白,并通过SDS-PAGE和western blot 进行鉴定.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误.宿主菌BL21经IPTG诱导表达并纯化得到目的 蛋白GFAP-GST融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定分子量约为70～90 kD,符合预期,western blot证实该目的 蛋白能被特异性抗人GFAP多克隆抗体识别.结论 成功构建GFAP表达载体,并可通过原核表达获得高纯度的目的 蛋白,为进一步开展相关研究打下基础.
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伴放线放线杆菌cdtC基因的克隆及其原核表达载体pET15b-cdtC的构建
目的:本实验设计克隆Aa CdtC亚基蛋白的编码基因cdtC并构建其原核表达载体pET 15b-cdtC,为研究CdtC亚基对CDT全毒素功能的分子机制奠定基础.方法:厌氧培养Aa ATCC 29523,提取Aa基因组DNA,PCR反应扩增cdtC基因片段.将此片段克隆入pMD 19-T Vector,经限制性内切酶BamHI和Xho I酶切得到粘性末端cdtC片段,克隆入原核表达载体pET 15b中.结果:产物经PCR初步鉴定后进行DNA序列分析,测序结果与Genbank公布序列一致性达100%.结论:本实验成功克隆了cdtC基因,并成功构建了其原核表达载体pET 15b-cdtC.为深入研究CdtC亚基以及CDT全毒素分子作用机制奠定基础.
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人心肌肌钙蛋白I基因原核表达载体的构建与鉴定
目的 构建人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因的原核表达重组体并鉴定.方法 利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人cTnI的cDNA片段,设计引物将其第二和第四个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体,并导入宿主菌BL21(DE3)中,采用双酶切及PCR方法鉴定后测序.结果 经PCR扩增成功获得699bp的cTnI基因,重组体酶切分析及PCR显示结果与预想一致,测序正确.结论 成功克隆了cTnI基因并构建了原核表达重组体.
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LTB-NspA融合基因原核表达载体的构建及鉴定
目的:构建融合基因LTB-NspA的原核表达载体.方法:用PCR法从淋球菌和大肠杆菌标准株分别扩增出NspA和LTB基因,用重组PCR法通过接头将LTB与NspA融合,将其插入pET-30a中,并进行PCR、酶切和测序鉴定.结果:经PCR、酶切和测序分析,证实成功构建了LTB-NspA的原核表达载体.结论:LTB-NspA原核表达载体的成功构建,为研制淋球菌高效粘膜免疫疫苗奠定了基础.
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利用TA克隆载体构建pET15b-SOD1重组质粒
目的:利用pGEM-T Easy vector构建 pET15b-SOD1 重组质粒.方法: 以pBluescript II SK-SOD1质粒为模板, 应用pfu DNA 聚合酶,聚合酶链反应法(PCR) 扩增SOD1 cDNA.将扩增的SOD1 cDNA 与三磷酸脱氧腺苷(dATP) 反应,然后通过Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在SOD1 cDNA的3'末端加"A"并纯化,然后将纯化后的SOD1 cDNA与pGEM-T Easy vector直接连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,蓝白筛选,挑选白色克隆扩增、鉴定,重组的质粒命名为 pGEM-T Easy-SOD1.pGEM-T Easy-SOD1 和 pET15b 分别用Xho Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切, 采用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收所需片断,前者回收470 bp 的SOD1 cDNA片段,后者回收线性化的 pET15b 片段,将两者连接后转化大肠杆菌DH5α,抽提后的重组体质粒命名为pET15b-SOD1,然后对pET15b-SOD1进行酶切和核苷酸序列测序鉴定.结果:重组质粒pET15b-SOD1经测序分析证实:克隆入pET15b-SOD1的人SOD1 cDNA与GeneBank"AB087266"登录的人SOD1 cDNA序列一致,从而成功构建了pET15b-SOD1 重组质粒.结论:pET15b-SOD1重组质粒的构建为细胞穿透肽介导的SOD1转导提供了一对照载体.
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人源性基质金属蛋白酶-1原核表达载体的构建与鉴定
目的构建人源性基质金属蛋白酶-1(MMP-1)原核表达载体. 方法从人肝组织提取总RNA,以此为模板,逆转录巢式 PCR扩增MMP-1全编码区基因片段,构建含目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-C2x重组质粒亚克隆,经双酶切及核苷酸测序进行分析鉴定. 结果成功地构建了人MMP-1原核表达载体. 结论构建的人MMP-1原核表达载体,为以后MMP-1融合蛋白的表达并获得具有抗原性的MMP-1融合蛋白奠定了基础.
关键词： 人基质金属蛋白酶-1 原核表达载体 构建与鉴定
