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人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的基因克隆及序列分析
目的 获取人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A亚单位(HspA)的DNA(hspA),并将它克隆到质粒PinPointTMXa-3中进行核苷酸序列分析.方法 利用PCR技术扩增HspA的DNA,并将其定向插入PinPointTMXa-3载体中通过4种荧光染料标记,激光检测的方法进行核苷酸序列分析.结果 DNA序列分析表明,所克隆的HspA DNA序列与GenBank公布的一致.结论 本研究获得了序列正确的HspA基因,为其重组表达及相关研究奠定了良好基础.
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幽门螺杆菌ureB及ureB-hspA融合基因在减毒鼠伤寒沙门菌中的表达及小鼠的免疫应答
目的构建H.pylori ureB单基因及ureB和hspA融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗候选株,并进行初步的免疫原性分析. 方法将H.pylori ureB单基因及ureB和hspA融合基因分别克隆入pTrc99A-asd质粒的多克隆位点之内.挑取单菌落质粒鉴定后,分别将其电击经中间宿主X3730转入终宿主X4072,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达.将疫苗候选株经口或鼻免疫BALB/c小鼠. 结果疫苗候选株能够分别表达出相对分子质量(Mr)为64×103的UreB蛋白及77×103的UreB-HspA融合蛋白.在免疫BALB/c小鼠的肠液和血清中可以分别检测到针对H.pylori的特异性分泌型IgA和IgG抗体. 结论构建了能够表达幽门螺杆菌UreB及UreB-HspA融合蛋白的活菌疫苗候选株,为探索制备H.pylori口服活菌疫苗奠定了基础.
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幽门螺杆菌HspA和UreB双价侯选疫苗株的构建
目的 构建表达幽门螺杆菌的组成成分热休克蛋白A亚单位(HspA)和尿素酶B亚单位(UreB)的重组蛋白质的侯选菌株.方法 用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上分别扩增出HspA和UreB基因片段,将它们融合插入原核表达载体pET-22b(+)中,并在BL21(DE3)大肠杆菌表达.结果 经测序,HspA-UreB(HU)融合基因片段由2061bp组成,为编码687个氨基酸残基的多肽.SDS-PAGE和免疫印迹分析检测发现,融合基因表达的蛋白相对分子质量约为78×103,并证实该重组蛋白可以被幽门螺杆菌感染阳性患者的血清所识别,其免疫小鼠所得血清抗体可与纯化的HspA和UreB重组蛋白单体或融合体发生特异性的结合反应.同时观察到HspA的存在可使融合蛋白的尿素酶活性增加2倍以上.结论 HspA-UreB融合蛋白有可能作为一种有效的蛋白质疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗.
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幽门螺杆菌HspA亚基的表达与纯化
目的:利用原核表达载体高效表达幽门螺杆菌热休克蛋白A(HspA),并进行纯化.方法:PCR扩增hspA基因,将其克隆至原核表达载体pET22b,pQE-60,pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析表达.利用镍离子亲和层析对表达产物进行纯化.免疫印迹检测蛋白的抗原性.结果:PCR扩增得到hspA基因,在载体pQE-60中以HspA和HspA-His6两种形式得到表达,表达量高达菌体总蛋白的40%以上.经镍离子亲和层析后,纯化率分别为88.63%和86.32%,但HspA-His6在纯化过程中发生降解.免疫印迹实验表明,HspA和HspA-His6都有很好的抗原性.结论:实现了HspA蛋白的高效表达和纯化,为幽门螺杆菌HspA亚单位疫苗的免疫实验奠定基础.
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幽门螺杆菌热休克蛋白A与尿素酶B融合表达产物的初步纯化及其在小鼠体内免疫效应活性分析
目的:探讨幽门螺杆菌热休克蛋白A与尿素酶B融合蛋白的免疫生物学活性.方法:采用亲和层析、离子交换和凝胶过滤对幽门螺杆菌热休克蛋白A与尿素酶B融合蛋白进行初步纯化,用粗纯化蛋白对小鼠进行免疫,然后分析其免疫活性.结果:采用亲和层析或离子交换和凝胶过滤后,融合蛋白的纯度分别可达到65.6%和90.2%.该融合蛋白可诱导小鼠产生抗幽门螺杆菌的胃肠黏液IgA和血清IgG抗体,并促使免疫小鼠脾脏T淋巴细胞CD4+/CD8+比值的增加.结论:重组热休克蛋白A与尿素酶B融合蛋白可以诱导在未来免疫预防中起积极作用的免疫应答反应.
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人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆及表达
目的:扩增人幽门螺杆菌(Helicobacter py lori,Hp)热休克蛋白A(heat shock prot ein A,HspA)编码基因并构建其重组表达载体,进行核苷酸序列分析,并在E.coli BL21中表达,为疫苗的开发奠定了基础.方法:利用PCR技术从Hp基因组DNA中扩增热休克蛋白A(HspA)基因片段,目的基因经SacⅠ和XhoⅠ双酶切、纯化后,插入pET32a(+)载体.以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21并表达.结果:经PCR、酶切、测序分析表明 ,插入的基因片段为Hp HspA编码基因,与GenBank报道的相比较,核酸同源性达98%.经SDS-PAGE 分析,表达的融合蛋白分子量约为33 KD,其中目的蛋白的分子量约为13 KD.结论:成功地克隆并表达了Hp HspA编码基因,为HspA蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础.
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幽门螺杆菌双亚单位基因疫苗的构建及免疫原性研究
目的:构建幽门螺杆菌(Hp)两个保护性亚单位UreB、HspA融合基因疫苗并观察其免疫原性.方法:从Hp基因组分别扩增出UreB、HspA基因片段,采用重叠延伸PCR方法将两个基因片段构建融合基因,以BglⅡ和XhoⅠ酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经测序确认后转染COS-7细胞,Western blot检测目的蛋白表达,胫前肌注射免疫小鼠后收集血清检测特异性抗体效价.结果:经测序后证实成功将融合基因构建到真核表达载体中,免疫印记检测到目的蛋白表达,并具有良好的抗原性,免疫小鼠后能够产生特异性抗体.结论:成功构建Hp双价DNA疫苗,免疫小鼠后显示出良好的免疫原性,为Hp进一步基因疫苗的研究奠定了基础.
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幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆和表达
目的扩增幽门杆菌热休克蛋白A351bp的DNA片段,并将其克隆到pET-28a(+)质粒中高效表达.方法用PCR方法扩增的片段经测序后,用GoldKey分析软件进行序列分析,应用pET-28a(+)系统在受体菌BL21(DE3)pLysS中表达热休克蛋白.结果该序列表达的蛋白与已报道的热休克蛋白A序列相似.重组菌株用IPTG诱导后,经SDS-PAGE和薄层扫描分析,表达的外源蛋白的相对分子质量为18000,以包涵体的形式存在,表达产物占菌体总蛋白的64%.结论HspA是有可能做为H.p疫苗中的候选抗原成分.
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人幽门螺杆菌VacA与HspA双价候选疫苗抗原的克隆表达及鉴定
目的构建含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)和细胞空泡毒素(VacA)编码基因的重组载体,进行核苷酸序列分析,并在E.coli BL21中表达,研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础.方法利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中,扩增HspA、VacA编码基因片段,将目的基因HspA、VacA与载体pET32a(+)分别进行双酶切后,连接、测序;同时将重组载体pET32a(+)/HspA和pET32a(+)/VacA分别经Xhol、BamHI双酶切,通过凝胶电泳回收pET32a(+)/HspA和VacADNA片段,经T4连接酶将HspA和VacA编码基因通过酶切粘端进行连接,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体,并在大肠杆菌BL21中表达,表达产物经纯化后,以Western blot法检测其抗原性.结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp HspA和VacA编码基因,由1080bp组成,与GenBank报道的相比较,本实验克隆的基因有3.40%的碱基发生变异,导致1.10%的氨基酸残基改变;经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白Mr为59×103,其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103,可溶性表达产物占全菌总蛋白的18.96%;重组蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上;用Western blot法检测显示,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清所识别,具有良好的抗原性.结论成功地克隆并融合表达了Hp HspA和VacA,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制以及快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的基础.
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人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆及表达
目的 扩增人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)编码基因并构建其重组表达载体,进行核苷酸序列分析,并在E.coli BL21中表达,为疫苗的开发奠定了基础.方法 利用PCR技术从Hp基因组DNA中扩增热休克蛋白A(HspA)基因片段,目的 基因经SacⅠ和XhoⅠ双酶切、纯化后,插入pET32a(+)载体.以含目的 基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21并表达.结果 经PCR、酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp HspA编码基因,与GenBank报道的相比较,核酸同源性达98%.经SDS-PAGE分析,表达的融合蛋白分子量约为33 KD,其中目的 蛋白的分子量约为13 KD.结论 成功地克隆并表达了Hp HspA编码基因,为HspA蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础.
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人幽门螺杆菌VacA与HspA双价疫苗载体的构建
目的:构建含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HsPA)和空泡毒素(VacA)编码基因的重组载体,进行核甘酸序列分析,为在E.coliBL21中表达,及其抗原性的研究奠定基础.方法:利用分子克隆技术,扩增HpI-IspA、VacA编码基因,分别将其与载体pET32a(十)进行酶切、连接,同时将筛选的pET32a(+)/HspA和pET32a(+)/VaeA重组载体分别经Xho工、BamHI双酶切,通过凝胶电泳回收pET32a(+)/I--IspA和VaeA片段,经T4连接酶将pEI'32a(+),qtspA和VacA编码基因连接,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体.结果:经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为I--IpHspA和VacA编码基因,由1080bp组成,与GenBank报道的相比较,有3.4％的碱基发生变异,1.10％的氨基酸残基改变;但编码的蛋白质特性无本质性改变.结论成功地克隆了HpHspA和VacA编码基因,并构建了能够同时表达mpa和VacA蛋白的双价疫苗重组载体,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了良好的基础.
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人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆及序列分析
目的:获取含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A编码基因并构建其重组载体,进行核苷酸序列分析,为在E coli BL21中表达,疫苗的开发奠定基础.方法:利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中,扩增热休克蛋白A编码基因片段.将目的基因与pET32a(+)同时经kpnⅠ、BamHⅠ双酶切、纯化、连接后.转化含有目的基因的重组载体,进行序列分析.结果:经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp热休克蛋白A编码基因,与GenBank的报道相比较,有1.4%的bp发生变异,1.6%的氨基酸残基改变.其同源性高达98%.结论:成功地克隆了Hp热休克蛋白A编码基因,为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础.
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BALB/c小鼠口服重组幽门螺杆菌热休克蛋白A疫苗的免疫应答
目的评价重组热休克蛋白A(rHspA)作为幽门螺杆菌(Hp)口服疫苗成分的效果.方法采用重组Hp保护性抗原HspA与粘膜免疫佐剂(霍乱毒素,CT;大肠不耐热肠毒素B亚单位,LTB)共口服免疫BALB/c小鼠,ELISA分析小鼠血清、胃肠粘液中IgA、IgA抗体水平,体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况以及IL4、IFN-γ的变化.结果单纯口服rHspA组产生的抗体水平与对照组(PBS)相差不显著,而rHspA+佐剂组与对照组相差非常显著.rHspA+佐剂组小鼠脾淋巴细胞体外培养,在Hp抗原刺激作用下出现明显的增殖反应;不加佐剂免疫组分泌IFN-γ水平增加,IL-4水平未发现增加;而加佐剂免疫组除IFN-γ水平增加外,IL-4水平也发现显著增加.结论BALB/c小鼠口服rHspA和CT以及LTB混合制剂能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答.
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Balb/c小鼠口服幽门螺杆菌疫苗rLTB-HspA的免疫应答
目的研究幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A (rHspA)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白(rLTB-HspA)作为口服疫苗的免疫应答效果.方法采用rLTB-HspA口服免疫Balb/c小鼠,ELISA分析小鼠血清、胃肠黏液中IgG、IgA抗体水平,体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况及IL-4、IFN-γ的变化.结果 Balb/c小鼠口服rLTB-HspA能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答.结论 Balb/c rLTB-HspA可作为预防和治疗Hp感染的候选疫苗之一.
关键词： 幽门螺杆菌 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 热休克蛋白A 免疫应答 -
人幽门螺杆菌18 000外膜蛋白与HspA双价疫苗的构建和表达
目的:构建含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)和Mr为18 000的外膜蛋白编码基因的重组载体, 进行核苷酸序列分析, 并在E.coli BL21中表达.方法:用PCR方法从Hp DNA染色体中, 扩增HspA编码基因片段.将目的基因HspA与载体pET32a(+)分别经kpnⅠ和BamH I 双酶切后, 进行连接、测序.同时将重组载体pET32a(+)/HspA和pET32a(+)/Omp18, 分别经Hind III和BamH I 双酶切, 通过凝胶电泳回收pET32a(+)/HspA和Mr 18 000 OMP DNA片段, 经T4连接酶将HspA和Mr 18 000 OMP编码基因通过酶切粘端进行连接, 而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体, 并在大肠杆菌BL21(DE30)中表达.表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后, 以Western blot分析其抗原性.结果:经酶切、测序表明, 插入的基因片段为Hp HspA和Mr为18 000 OMP编码基因, 由891个碱基组成, 与GenBank中登录的序列相比较, 有1.15%的碱基发生变异, 1.26%的氨基酸残基改变.经SDS-PAGE分析发现, 融合基因表达的蛋白Mr为51×103 , 其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103, 可溶性表达产物占菌体总蛋白的18.96%.重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后, 其纯度达95%以上.用Western blot分析显示, 该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗Mr为18 000 OMP单克隆抗体所识别, 具有良好的抗原性.结论:成功地克隆并融合表达了Hp HspA和Mr为18 000 OMP, 为Hp疫苗和快速诊断试剂盒的研制奠定了基础.
