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Neuralized siRNA表达载体的构建及鉴定
目的 构建Neuralized siRNA干扰载体并观察其对细胞中Neuralized表达水平的影响.方法 化学合成靶向Neuralized的短发夹寡核苷酸序列,与线性化pGPU6/Neo质粒退火连接.酶切后测序鉴定正确,转染入HEK293细胞.利用Western blot和间接免疫荧光技术分析Neuralized siRNA载体对细胞中Neuralized表达及其定位的影响.结果 Neuralized siRNA干扰载体经酶切及测序分析表明,目的核苷酸序列成功插入预计位点且序列正确；Neuralized siRNA干扰载体转染HEK293细胞后,Western blot检测显示,Neuralized siRNA干扰载体明显降低细胞中Neuralized蛋白表达；间接免疫荧光显示,转染4种Neuralized siRNA均能使定位于细胞膜上的Nneuralized蛋白的荧光强度变暗.结论 Neuralized siRNA干扰载体成功构建,且能明显抑制细胞中Neuralized的表达.
关键词： Neuralized SiRNA干扰 -
RNA干扰TAK1表达以增强三氧化二砷抑制Kasumi-1细胞增殖的作用及其机制研究
目的:探讨沉默转化生长因子β激活激酶(TAK1)基因表达对三氧化二砷(As2O,)抑制人t(8;21)急性髓系白血病细胞株Kasumi-1增殖的影响及其可能机制.方法:实验分为4组:对照组,TAK1特异siRNA转染Kasu-mi-1细胞组,As2 O3作用组及两者联合处理的Kasumi-1细胞组.采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测TAK1、p-JNK及凋亡相关蛋白的表达.结果:在0.5-20 μmol/L范围内,As2O3作用于Kasumi-1细胞24h能够浓度依赖性地抑制Kasumi-1细胞增殖,24 h的IC50值为(3.79±0.36)μmol/L;在0.5-10 μmol/L范围内,As2O3作用于Kasumi-1细胞48 h能够浓度依赖性地抑制Kasumi-1细胞增殖;之后As2O3对Kasumi-1细胞的增殖抑制作用进入平台期,48 h的IC50值为(2.38±0.17)μmol/L.TAK1siRNA转染组和As2O3 3.5 μmol/L作用24 h组,Kasumi-1细胞的增殖抑制率分别为(10.86±1.64)％和(49.80±2.19)％,凋亡率分别为(8.47±0.75)％和(24.78±2.14)％,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);两者联合作用于Kasumi-1细胞的增殖抑制率为(65.63±0.83)％,凋亡率为(68.97±2.94)％,与对照组和各单独组比较,差异均有统计学意义(P＜0.001).TAK1 siRNA转染和As2 O3作用Kasumi-1细胞24 h能不同程度下调TAK1、p-JNK、c-Fos、c-Jun、BCL-2的表达,上调BAX和活化型(cleaved) Caspase-3、9的表达,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),两者联合后该作用进一步加强(P＜0.05).结论:利用RNA干扰技术沉默TAK1表达能够增强As2O3抑制Kasumi-1细胞增殖的作用,其原因可能是通过TAK1下游的JNK信号传导通路,以及线粒体途径诱导细胞凋亡实现的.
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RNA干扰Survivin基因治疗大肠癌作用机制的研究进展
Survivin(生存素)作为IAP家族成员之一,被认为是迄今为止发现的强的凋亡抑制因子.以siRNA干扰Survivin的表达靶向观察其对大肠癌细胞基因的表达及对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制.
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siRNA沉默Galectin-3基因对血管内皮EA.hy926细胞增殖和迁移影响
目的 半乳糖凝集素-3(Galectin-3)在肿瘤血管形成中起重要作用,关于其在血管内皮细胞生物学行为中的研究较少.本研究探讨siRNA转染下调Galectin-3表达对血管内皮EA.hy926细胞增殖和迁移能力的影响.方法 将EA.hy926细胞分为干扰组、阴性对照组和空白对照组,干扰组转染Galectin-3特异性小干扰RNA (small interference RNA.siRNA),阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组只加转染空白试剂.蛋白质印迹法检测转染前后EA.hy926细胞内Galectin-3蛋白表达的变化,MTT比色法检测转染前后EA.hy926细胞增殖变化,Transwell小室法检测转染前后EA.hy926细胞迁移变化.结果 干扰组EA.hy926细胞转染3条靶向siRNA后,Galectin-3蛋白表达量分别为0.07±0.02、0.25±0.01和0.26±0.04,其中序列1的干扰效果佳.转染序列1的EA.hy926细胞中Galectin-3蛋白表达低于阴性对照组的0.77±0.05(t=9.52,P=0.011),也低于空白对照组的0.87±0.11(t=11.23,P=0.003),故选择转染序列1的细胞作为干扰组进行后续实验.干扰组EA.hy926细胞增殖能力在72 h为0.38±0.02,低于阴性对照组的0.52±0.01(t=11.32,P=0.001)和空白对照组的0.54±0.01(t=11.73,P=0.001).干扰组EA.hy926细胞迁移的细胞数目为32.67±9.02,低于阴性对照组的84.00±2.65(t=12.54,P=0.001)和空白时照组的85.33±4.73,t=12.66,P=0.001.结论 靶向Galectin-3的特异siRNA能够下调Galectin-3在EA.hy926细胞中的蛋白表达水平,有效抑制EA.hy926细胞的增殖和迁移能力.
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siRNA干扰MACC1表达对前列腺癌细胞株PC-3生长与侵袭影响研究
目的 结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer 1,MACC1)在肿瘤侵袭和转移中起重要作用,在前列腺癌中的研究较少,本研究探讨siRNA转染下调MACC1表达对前列腺癌细胞株PC-3增殖和侵袭的影响.方法采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)法检测10例前列腺癌和其癌旁组织及4种前列腺癌细胞株(LNCap、PC-3、DU145、C4-2) MACC1 mRNA的表达;将前列腺癌细胞株PC-3分为实验组、阴性对照组和空白对照组,实验组转染MACC1特异性小干扰RNA(small RNA interference,siRNA) (MACC1 siRNA),阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组不做处理.RT-PCR法及蛋白质印迹法检测siRNA转染前后MACC1 mRNA及蛋白水平的变化,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测转染后PC-3细胞增殖变化,Transwell小室法检测PC-3细胞侵袭能力的变化,蛋白质印迹法检测Met/MAPK信号通路蛋白改变.结果 10例前列腺癌组织中MACC1 mRNA相对表达量为0.82±0.27,高于癌旁组织的0.09±0.05,t=23.20,P＜0.001;前列腺癌细胞株PC-3、DU145和C4-2 MACC1 mR-NA的表达分别为0.86±0.19、0.65±0.23和0.77±0.23,高于LNCap细胞的0.17±0.07.实验组PC-3细胞转染siRNA后,MACC1 mRNA表达为0.16±0.03,低于阴性对照组的0.79±0.04,t=7.91,P＜0.001;也低于空白对照组的0.81±0.34,t=8.61,P＜0.001.实验组MACC1蛋白表达量为0.10±0.01,显著低于阴性对照组的0.39±0.045,t=11.21,P＜0.001;也低于空白对照组的0.41±0.10,t=11.73,P＜0.001;MACC1 siRNA组PC-3细胞增殖能力在72 h分别为0.58±0.65,低于阴性对照组的1.18±0.10和空白对照组的1.23±0.05,P＜0.001;MACC1 siRNA组PC-3细胞侵袭的细胞数目为126.0±9.8,低于阴性对照组233.3±12.0及空白对照组242.3±11.5,P＜0.05.转染后Met、p-MEK1/2和p-ERK1/2的MACC1 siRNA蛋白相对表达量分别为0.47±0.03、0.34±0.03和0.94±0.03,较对照组的0.26±0.04、0.10±0.11和0.10±0.12明显降低,P＜0.05;MEK1/2和ERK1/2蛋白相对表达量无明显下降,P＞0.05.结论MACC1可能通过上调Met和MAPK信号通路促进前列腺癌细胞的恶性行为.
关键词： 前列腺癌 SiRNA干扰 结肠癌转移相关基因1 细胞增殖 细胞侵袭 -
siRNA干扰ARK5蛋白表达对U251细胞侵袭潜能影响机制探讨
目的:探讨siRNA干扰降低腺苷酸活化蛋白激酶5(AMPK-related protein kinase 5,ARK5)表达对U251细胞侵袭潜能的影响及其机制.方法:采用蛋白质印迹法检测U251细胞中ARK5表达.应用siRNA干扰技术转染U251细胞株,并采用蛋白质印迹法检测瞬时转染后ARK5蛋白表达情况.通过体外侵袭实验检测细胞转染后侵袭能力的变化.ARK5下降后,蛋白质印迹法检测间质细胞来源的YKL-40、N-eadherin、Vimentin蛋白和调节因子Snail、Slug、Twist1和Zeb1的表达.结果:转染ARK5质粒的U251细胞ARK5表达下降.ARK5表达降低的U251细胞侵袭并穿透Matrigel膜基质的细胞数量为22,U251对照组为41,SCR/U251对照组为42,两两比较,ARK5表达降低的实验组透膜数比两对照组少(P＜0.001),同时蛋白质印迹法结果显示,YKL-40、N-cadherin和Vimentin蛋白表达量降低,与间质转化相关的转录因子仅Snail的表达降低,而转录因子Slug、Twist1和Zeb1表达无明显改变.结论:应用siRNA干扰技术降低ARK5蛋白的表达使U251细胞侵袭转移能力降低,同时YKL-40、N cadherin和Vimentin蛋白和转录因子Snail的表达量降低,提示ARK5蛋白表达降低可通过调节间质转化影响U251细胞的侵袭.
关键词： U251 SiRNA干扰 腺苷酸活化蛋白激酶5 间质转化 侵袭 -
BMK1表达对胶质瘤细胞U87侵袭能力影响机制探讨
目的 探讨大丝裂原活化蛋白激酶1 (big mitogen-activated protein kinase 1,BMK1)表达对U87细胞侵袭能力的影响及作用机制.方法 应用siRNA干扰技术转染U87细胞株,并采用蛋白质印迹法检测U87细胞中BMK1表达及转染后BMK1表达情况.体外癌细胞侵袭实验检测U87细胞转染后侵袭能力变化.BMK1下降后,蛋白质印迹法检测间叶细胞特异性标记蛋白N-cadherin、T-cadherin、Vimentin和转录因子Snail、Slug、Twist1、Zeb1的表达.结果 蛋白质印迹法检测结果显示,U87细胞中BMK1相对表达量为1.0±0.21,SCR/U87细胞中BMK1相对表达量为1.1±0.18,SiBMK1/U细胞中BMK1相对表达量为0.45±0.12,差异有统计学意义,F=12.129,P=0.008.体外癌细胞侵袭实验显示,SiBMK1/U87实验组穿透Matrigel膜基质的细胞数为106±18,SCR/U87对照组为61±15,U87对照组为62±14,差异有统计学意义,F=7.977,P=0.020;U87对照组与SCR/U87对照组差异无统计学意义,P=0.941;而SiBMK1/U87实验组穿透基膜的细胞数明显多于U87对照组(P=0.014)和SCR/U87对照组(P=0.013),差异有统计学意义.蛋白质印迹法结果显示,SCR/U87和SiBMK1 /U87细胞中N-cadherin相对表达量分别为1.0±0.13和3.8±0.31,t=-14.427,P＜0.001;Vimentin相对表达量分别为1.5±0.16和3.9±0.22,t=-15.281,P＜0.001;T-cadherin相对表达量分别为4.5±0.12和1.3±0.14,t=30.059,P＜0.001.SCR/U87和SiBMK1/U87细胞中Twist1蛋白相对表达量分别为0.75±0.14和2.3±0.22,t=-10.295,P=0.001,差异有统计学意义.表明BMK1表达影响Twist1的表达.结论 BMK1与U87细胞侵袭性显著相关,其侵袭性的调控是通过间叶转化(mesenchymal transition,MT)实现的.
关键词： U87细胞 SiRNA干扰 大丝裂原活化蛋白激酶1 间叶转化 侵袭 -
沉默p70S6K表达可提高食管鳞癌细胞对雷帕霉素的敏感性
目的 探讨不同分化程度的食管鳞癌细胞对雷帕霉素的敏感性差异以及以p70S6K-siRNA干扰p70S6K表达后食管鳞癌EC9706细胞对雷帕霉素敏感性的变化.方法 以细胞计数盒8(CCK-8)法检测雷帕霉素对不同分化程度食管鳞癌细胞(EC9706、TE-1、Eca109、KYSE790、KYSE450)增殖的影响,并根据检测结果,选取对雷帕霉素不敏感的EC9706细胞株转染p70S6K-siRNA.采用CCK-8法、流式细胞术和裸鼠成瘤实验,检测转染前后EC9706细胞对雷帕霉素敏感性的变化.结果 CCK-8法检测结果显示,5株食管鳞癌细胞对低浓度雷帕霉素(≤100 nmol/L)均敏感,而低分化细胞株TE-1和EC9706对高浓度雷帕霉素却易产生耐药性.经50、100、200、500和1 000 nmol/L雷帕霉素+p70S6K-siRNA处理后,EC9706细胞的增殖率分别为(48.67±1.68)％、(15.45±1.54)％、(14.00±0.91)％、(10.97±0.72)％和(2.70±0.32)％,均分别明显低于50、100、200、500和1000 nmol/L雷帕霉素+对照siRNA处理组[(74.53±1.71)％、(68.27± 1.35)％、(71.74±2.44)％、(76.23±1.02)％和(80.21±2.77)％,均P＜0.05].流式细胞仪检测结果显示,p70S6K-siRNA组、雷帕霉素组和p70S6K-siRNA+雷帕霉素组EC9706细胞中G1期细胞的比例分别为(53.82±1.78)％、(57.87±4.01)％和(73.73±3.68)％,均明显高于对照组[(46.09±2.31)％,均P＜0.05].裸鼠体内实验的结果显示,转染p70S6K-siRNA后,雷帕霉素对裸鼠体内移植瘤生长的抑制作用也增强,抑瘤率高达96.5％.结论 不同分化程度的食管鳞癌细胞对雷帕霉素的敏感性不同,p70S6K-siRNA在体内外均能提高食管鳞癌EC9706细胞对雷帕霉素的敏感性.
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HL-60细胞诱导分化过程中STIM1siRNA干扰的电转染研究
目的:以感受器相互作用分子(STIM1)为报告基因优化悬浮培养的二甲基亚砜(DMSO)诱导分化的HL-60细胞的电穿孔转染条件.方法:通过控制电压、电容、电阻、细胞状态等转染条件,采用不同条件组合后用电穿孔法将靶向STIM1的siRNA转入悬浮培养的dHL-60细胞,用荧光显微镜观察转染率,蛋白免疫印记方法检测干扰效率.结果:适当提高电压能提高悬浮培养的dHL-60细胞的转染效率,细胞状态不同干扰效率有所差异,DMSO诱导4d的dHL-60细胞在电压295V、电容1 180μF、电阻500Ω的条件下转入STM1 siRNA系列并得到大干扰效率(约60％).结论:针对dHL-60细胞这种比较特殊的细胞系来说,电穿孔转染法是一种较好的基因转染方法,通过优化其转染条件,可以提高其对dHL-60细胞的SiRNA干扰效率.
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沉默TAK1表达对三氧化二砷诱导Kasumi-1细胞凋亡的影响
目的 利用RNA干扰技术研究沉默转化生长因子β激活激酶(TAK1)对三氧化二砷(As2O3)诱导的急性髓系白血病(AML)细胞增殖和凋亡的影响.方法 以伴t(8;21)的AML细胞株Kasumi-1为对象,用CCK-8法检测As2O3对Kasumi-1细胞的增殖抑制作用；Western blot方法检测As2O3作用不同时间后Kasumi-1细胞磷酸化c-Jun N端激酶(P-JNK)的表达；以TAK1特异的siRNA转染Kasumi-1细胞后用As2O3处理细胞作为实验组,同时设立对照组,检测P-JNK表达水平,比较不同处理条件下细胞凋亡率、集落形成率.结果 不同浓度As2O3作用于Kasumi-1细胞后,细胞增殖抑制率呈浓度依赖性增高,半数抑制浓度为3.5 μmol/L;As2O3作用Kasumi-1细胞不同时间后,P-JNK表达均明显增强,以30 min强；未作任何处理的Kasumi-1细胞、TAK1特异siRNA单纯转染的Kasumi-1细胞、As2O3单独处理的Kasumi-1细胞、TAK1 siRNA转染联合As2O3处理的Kasumi-1细胞凋亡率分别为(5.02±1.13)％、(6.18±0.28)％、(48.33±2.70)％、(86.07±2.21)％,集落形成率分别为(73.83±2.78)％、(76.03±1.46)％、(55.07±1.50)％、(22.20±1.15)％,单纯TAK1siRNA转染组细胞凋亡率与Kasumi-1细胞未处理组比较差异无统计学意义(P=0.052),其余各组凋亡率比较差异有统计学意义(P=0.000)；单纯TAK1siRNA转染的Kasumi-1细胞集落形成率与未处理组比较差异无统计学意义(P =0.179),但与其余各组集落形成率比较差异有统计学意义(P =0.000).结论 沉默TAK1基因表达可增强As2O3对Kasumi-1细胞增殖抑制及诱导凋亡作用,其机制可能通过TAK1下游传导信号JNK途径.
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pSilencer4.1-cmv-TrkC质粒对前列腺癌细胞株PC3增殖的影响
[目的]通过pSilencer4.1-cmv-TrkC siRNA干涉质粒转染下调人前列腺癌细胞系PC3中酪氨酸激酶受体C(tyrosine lcinase C,TrkC)的表达,观察TrkC在前列腺癌细胞中的作用.[方法]根据TrkC基因序列设计并合成siRNA,构建质粒.用脂质体将pSilencer/TrkC和对照空载体pSilencer转染人前列腺癌细胞系PC3,通过Western blotting检测转染细胞的TrkC表达情况,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测TrkC对细胞周期及凋亡的影响.[结果]成功利用脂质体转染PC3细胞后,Western blotting 鉴定结果显示:TrkC的表达水平显著降低,细胞生长曲线及流式细胞仪检测结果显示pSilencer4.1-cmv-TrkC脂质体转染的PC3细胞出现生长抑制及凋亡增加.[结论]下调TrkC表达可以抑制前列腺癌细胞PC3增殖,TrkC可能参与了前列腺癌的发生发展过程.
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酪氨酸激酶受体C在膀胱癌SCaBER细胞裸鼠种植瘤中的作用
[目的]通过酪氨酸激酶受体C (tyrosine receptor kinase,TrkC)siRNA干涉质粒下调膀胱癌细胞SCaBER裸鼠种植瘤中TrkC的表达,分析TrkC在膀胱癌中的作用.[方法]采用构建SCaBER细胞裸鼠种植瘤模型,以脂质体LipofectAmine 2000为介质,采用瘤内注射的方法,用TrkCsiRNA干涉质粒实现下调SCaBER细胞中TrkC的表达,以空载体pSilencer作为阴性对照,干涉过程中记录裸鼠种植瘤的体积变化,绘制种植瘤生长曲线,干涉结束后处死裸鼠,剥除肿瘤,拍照,称重,并提取蛋白,western blotting检测干涉效果.[结果]Western blotting检测发现,构建的TrkCsiRNA干涉质粒顺利实现了在SCaBER细胞裸鼠种植瘤中对TrkC的表达的下调(F=7.46,P＜ 0.05),种植瘤生长曲线表明下调TrkC的表达可以抑制SCaBER细胞在裸鼠活体内的增殖,实验组肿瘤肿瘤体积(F=11.50,P＜ 0.05)和重量(F=19.32,P＜ 0.01)明显低于对照组.[结论]下调TrkC表达可抑制膀胱癌细胞SCaBER在活体内增殖,TrkC可能参与膀胱癌发生发展过程.
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SiRNA沉默Sox-9基因调控骨骺干细胞的增殖及凋亡
背景：目前有研究表明，很多细胞生长因子可促进骨骺干细胞的增殖和分化，并且这种调控作用与Sox-9有密切的关系。
目的：观察小分子干扰RNA沉默Sox-9基因及对大鼠骨骺干细胞增殖、凋亡的影响。
方法：采用酶消化法分离、免疫磁珠法纯化及免疫组织化学SABC法鉴定得到大鼠骨骺干细胞，首先进行预转染Sox-9 siRNA，判断转染效率，实验分2组：对照组常规培养，实验组采用Sox-9 siRNA转染。
结果与结论：实验成功分离、纯化了原代骨骺干细胞，生长状态稳定、贴壁牢固，光学显微镜下细胞多呈梭形。免疫组织化学染色和免疫荧光鉴定显示，Sox-9 siRNA转染的大鼠骨骺干细胞可稳定表达相对特异性标志物成纤维细胞生长因子受体3。RT-PCR，MTT，流式细胞仪检测检结果提示，与对照组相比，实验组Sox-9 mRNA表达及细胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率增加(P<0.05)。结果证实，siRNA沉默Sox-9基因可调控大鼠骨骺干细胞的增殖和凋亡。 -
FABP-5基因沉默对宫颈癌SiHa细胞生物学特性的影响
背景：研究发现肿瘤相关基因以及肿瘤基因通路的改变在肿瘤的形成与发展中起重要作用。
目的：探讨siRNA干扰技术沉默FABP-5基因表达对人宫颈癌SiHa细胞生物学特性的影响。
方法：以人宫颈癌SiHa细胞为研究对象，根据FABP-5 mRNA编码序列设计并合成干扰siRNA序列，瞬时转染SiHa细胞。用RT-PCR和Western blot法分别从mRNA水平和蛋白水平检测FABP-5基因的表达；流式细胞技术检测各组细胞周期的变化；CCK-8法测定细胞体外增殖能力；细胞侵袭小室法检测各组细胞的体外侵袭力；TUNEL染色检测各组细胞的凋亡情况。
结果与结论：与转染空病毒阴性对照组和未转染空白对照组比较，FABP-5 siRNA组FABP-5 mRNA和蛋白表达明显下降，细胞生长速度明显减慢，细胞周期阻滞在G0/G1期，S期细胞数减少，细胞侵袭力显著下降，细胞凋亡率明显升高。结果说明siRNA技术可以成功诱导FABP-5基因沉默，从而影响宫颈癌SiHa细胞的的生长、增殖和凋亡。 -
Homer1b/c在缺氧复氧损伤神经元中的保护作用研究
目的:探讨Homer1 b/c在缺氧复氧损伤神经元中的作用.方法:构建pcDNA3.1-Homer1 b/c质粒和Homer1b/c siRNA,过表达及siRNA干扰Neuro-2a细胞中Homer1b/c的水平,western blot分析观察上调及下调Homer1 b/c后Homer1 b/c的蛋白表达变化,再予细胞缺氧复氧损伤处理,观察细胞生存率、乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)释放量及caspase-3活性的变化.结果:过表达及siRNA干扰Homer1 b/c后,Homer1b/c的蛋白水平分别较正常组明显增高及降低(P值分别＜0.01),提示过表达及干扰Homer1b/c的效果均明显,分别能明显提高及降低Homer1b/c的水平.在缺氧复氧损伤条件下,Homer1 b/c过表达组较空质粒转染组,其细胞生存率明显增加,LDH释放量、caspase-3活性明显降低(P值分别＜0.05);相反,下调Homer1b/c的水平后,与controlsiRNA转染组相比,细胞生存率明显降低,而LDH释放量和caspase-3活性明显增加(P值分别＜0.05).结论:Homer1b/c在缺氧复氧损伤神经元中具有神经保护作用.
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siRNA干扰cytohesins导致前列腺癌细胞中IGFR信号减低
Cytohesins在前列腺癌的IGFR信号转导中发挥重要作用.siRNA干扰cytohesins可以减低前列腺癌的IGFR信号,表明cytohesins可以成为治疗前列腺癌的一个新靶点.
关键词： Cytohesins IGF-1R 信号转导 前列腺癌 SiRNA干扰 -
Decorin基因表达对人肺腺癌A549细胞生物学行为的影响
目的：探讨Decorin表达降低对人肺腺癌A549细胞的生物学行为的影响。方法体外化学合成DCN－siRNA特异性序列，在LipofectamineTM2000的介导下转染人肺腺癌A549细胞；分别采用RT－PCR法和Western blot方法检测Decorin基因和蛋白表达情况；CCK－8法检测细胞的增殖能力；流式细胞技术检测细胞凋亡；Transwell小室测定细胞侵袭能力；划痕实验检测肿瘤细胞迁移能力。结果 RT－PCR及Western blot证实靶向Decorin的siRNA干扰明显降低了A549细胞Decorin mRNA和蛋白表达水平。 CCK－8检测结果显示与对照组比较，siRNA干扰组A549细胞增殖能力增强，差异具有统计学意义（P＜0．05）。流式细胞技术显示，DCN－siRNA组与对照组比较凋亡率差异无统计学意义（P＝0．214）。Transwell侵袭实验显示siRNA干扰后，A549细胞穿膜细胞数明显多于对照组（P＜0．05）。细胞划痕实验显示与空载体组比较，DCN－siRNA组细胞48 h、72 h细胞生长明显增多，愈合加快。结论应用siRNA技术在肺腺癌细胞中下调Decorin表达促进了A549细胞的增殖，迁移以及侵袭能力，不影响细胞的凋亡能力。该结果为Decorin在肺癌的作用及功能方面的研究提供了新的证据。
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细胞周期激酶亚单位1对肝细胞癌细胞增殖能力的影响
目的 观察细胞周期激酶亚单位1(CKS1)在肝细胞癌及正常肝组织中的表达以及其对人肝细胞癌细胞BEL-7405的增殖能力的影响.方法 应用免疫组织化学检测65对手术肝细胞癌组织及癌旁正常组织CKS1的表达水平.应用Western印迹检测肝癌细胞系与正常肝脏细胞中CKS1表达量的差异.应用小于扰RNA(siRNA)技术转染肝细胞癌BEL-7405细胞,Western印迹检测CKS1 siRNA对CKS1蛋白的干扰效果,同时应用细胞计数试剂盒(CCK-8)和平板克隆增殖实验检测CKS1对BEL-7405细胞增殖能力的影响.结果 免疫组织化学染色结果显示,CKS1在正常肝组织中表达量较肝细胞癌组织中表达量低,且差异有统计学意义(P＜0.05).Western印迹检测表明CKS1在7种肝细胞癌细胞系表达量显著高于正常肝细胞株,且CKS1的表达量在肝细胞癌BEL-7405细胞株显著高于其他肝癌细胞株.CCK-8法检测CKS1的siRNA转染BEL-7405细胞与阴性对照组和空白对照组相比明显抑制细胞增殖,在48、72和96 hA值分别降低了0.376、0.566、0.972(P＜0.05);平板克隆增殖形成实验表明,CKS1的siRNA转染BEL-7405细胞后肿瘤细胞形成的克隆增殖集落明显少于阴性对照组和空白组,干扰组与空白、阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CKS1在肝细胞癌组织中表达量显著高于正常肝组织,在肝癌细胞中表达量显著高于正常肝细胞,CKS1在肝细胞癌细胞BEL-7405的增殖中扮演了重要的角色,CKS1可能成为针对肝细胞癌基因治疗的新兴靶点.
关键词： 肝细胞癌 细胞周期激酶亚单位1 SiRNA干扰 细胞增殖 -
Smad4静默对K-ras突变小鼠胰腺PanIN细胞增殖及转移能力的影响
背景与目的：由己建立的小鼠基因打靶模型证实，K-ras突变启动了胰腺癌前病变-胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)，p53、p16失活均可单独促进小鼠PanIN发展为浸润性胰腺癌。作为人胰腺癌中另一失活频率高发的抑癌基因Smad4，本课题组前期研究提示，应用RNA干扰技术沉默PanIN细胞株中内源性Smad4表达，促使PanIN细胞恶性转化。基于此目的，本研究进一步探讨siRNA干扰Smad 4基因对PanIN细胞体内外增殖及转移能力的影响，从而有助于阐明PanIN恶性转化的新机制。方法：构建和筛选能特异性静默PanIN细胞中Smad4表达的佳siRNA稳定表达质粒,稳定转染佳siRNA表达质粒进入PanIN细胞，用Zeocin筛选稳定转染克隆，挑选阳性克隆、扩增，稳定转染后细胞命名为PanIN-S。本研究运用细胞计数、克隆形成实验等分别比较两组在活细胞率和体外增殖能力的影响，同时为进一步验证Smad 4基因静默对PanIN细胞体外迁移、侵袭能力的影响，本研究采用Transwell和Mitigel assay检测其干扰前后体外运动、侵袭能力。动物实验中，建立PanIN及PanIN-S细胞组裸鼠移植瘤模型，并应用免疫组化方法检测并比较两组PCNA、VEGF和MMP-9的表达及其差异。结果：成功构建了Smad4基因siRNA体系；体外实验中与PanIN组相比， PanIN-S组细胞增殖、侵袭能力明显增强，差异有统计学意义(P<0.05)；动物模型免疫组化结果显示，与PanIN组相比，PanIN-S组PCNA、VEGF和MMP-9表达显著增高(P<0.05)。结论：K-ras突变基础上小鼠PanIN细胞Smad4基因静默促使PanIN细胞的恶性转化；PanIN基础上Smad4静默促使小鼠PanIN细胞体内外增殖及转移能力的增强，其增殖及转移可能与PCNA、VEGF和MMP-9高表达有关。
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Smad4基因沉默促进PanIN裸鼠移植瘤增殖和微血管形成的研究
背景与目的:由已建立的小鼠基因打靶模型证实,K-ras突变启动了胰腺癌前病变一胰腺腺管内上皮瘤(pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN),p53或p16失活均可单独促进小鼠PanIN发展为浸润性胰腺癌.作为人胰腺癌中另一失活频率高发的抑癌基因Smad4,其失活对PanIN的转化作用及是否可单独促进PanIN发展为胰腺癌目前仍不清楚.基于此目的,在已成功分离建立K-ras突变启动的PanIN细胞株基础上,本研究拟进一步应用RNA干扰技术沉默PanIN细胞株中内源性Smad4表达,以探讨siRNA干扰Smad4基因对PanIN细胞恶性转化作用.方法:构建Smad4基因沉默慢病毒质粒,筛选Smad4沉默稳转细胞并命名为PanIN-S细胞;分别用PanIN和PanIN-S细胞并采用皮下接种的方法,构建获得PanIN及PanIN-S细胞组裸鼠移植瘤模型(每组5只),2周后测定各组肿瘤体积和质量;应用免疫组织化学SP法检测并比较各组增殖细胞核抗原(PCNA)和CD31的表达及其差异.结果:成功构建了Smad4基因SiRNA体系;与未干扰PanIN细胞组相比,PanIN-S组裸鼠肿瘤体积和质量显著增加(P<0.05);组织病理学检查,符合胰腺癌(腺癌);免疫组织化学结果显示PCNA和CD31表达显著增高(P<0.05).结论:Smad4基因沉默可促使在K-ras突变基础上的小鼠PanIN细胞的恶性转化;裸鼠移植瘤中Smad4失活可显著促进小鼠移植瘤增殖和肿瘤微血管形成,这些可能是其致瘤恶性转化的重要作用机制.
