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膀胱癌循环肿瘤细胞NANOG基因的表达与临床特征相关性的初步研究
目的 探讨膀胱癌患者外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)及其中Nanog基因的阳性表达率与临床特征的相关性.方法 选取2015年12月至2016年8月陆军军医大学第一附属医院全军泌尿外科研究所收治的膀胱尿路上皮癌患者59例,采用广州益善生物技术股份有限公司开发的CanpatrolTM技术检测患者外周血中的CTCs分布情况及CTCs中Nanog基因的表达水平,分析上述检测结果与患者性别、年龄、肿瘤分级、浸润程度、淋巴结活检以及转移情况之间的相关性.结果 肌层浸润性膀胱癌患者外周血中CTCs阳性率高于非肌层浸润性膀胱癌患者(33/36,91.7％ vs 14/23,60.9％,P=0.007);淋巴结活检阳性膀胱癌患者CTCs阳性率高于淋巴结活检阴性患者(19/20,95.0％vs 28/39,71.8％,P=0.044);混合型CTCs中Nanog基因的阳性率高于上皮型(22/56,39.3％ vs 96/176,54.5％,P=0.047).结论 CTCs可作为判断膀胱癌恶性程度和侵袭能力的辅助指标,CTCs中的Nanog基因有望成为评估膀胱癌转移和预后的生物标志.
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Nanog在肺癌中的表达及对吉西他滨联合顺铂化疗疗效的影响
目的 探讨中晚期(Ⅲ、Ⅳ期)肺癌患者Nanog的表达及对吉西他滨联合顺铂化疗疗效的影响.方法 采用免疫组化法检测62例肺癌患者Nanog的表达情况,研究其表达情况对吉西他滨联合顺铂化疗疗效的影响.结果 62例晚期肺癌患者中Nanog表达阳性30例(48.4％),吉西他滨联合顺铂化疗有效组32例患者中Nanog表达阳性9例(28.1％),阴性23例(71.9％)；无效组30例患者中Nanog表达阳性21例(70.0％),阴性9例(30.0％).无效组患者Nanog表达阳性率明显高于有效组(x2=10.872,P=0.001).结论 Nanog表达增强可导致肺癌患者对吉西他滨联合顺铂化疗不敏感,检测Nanog对临床制订肺癌个体化治疗方案有一定参考价值.
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NANOG基因对急性淋巴细胞白血病细胞增殖及细胞周期的影响
目的 探讨NANOG基因在人类急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞株中的表达,并研究下调该基因表达对ALL细胞增殖和细胞周期的影响以及可能机制.方法 选取ALL的MOLT-4、CCRF-HSB2、Jurkat 3种细胞系为研究对象.利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot技术检测MOLT-4、CCRF-HSB2、J urkat细胞系中NANOG的表达情况.通过构建携带NANOG基因的特异性shRNA的慢病毒载体包装病毒颗粒(pLB-shNANOG-1和pLB-shNANOG-2),该病毒感染MOLT-4细胞后,经分选获得稳定表达株作为实验组:shNANOG-1组和shNANOG-2组;以空质粒(pLB-sh control)感染的细胞和正常MOLT-4细胞分别作为阴性对照组和空白对照组.在基因及蛋白水平下,检测各组NANOG的干扰效率.采用CCK-8法及流式细胞仪检测实验组和对照组细胞增殖能力及细胞周期的变化,并利用实时定量PCR技术检测p53通路相关基因的表达变化.结果 包装病毒颗粒超速离心后病毒滴度达(1.83～3.12)×108 IU/mL.2种shRNA可有效下调病毒感染MOLT-4细胞的NANOG基因及蛋白的表达.CCK-8法检测显示shNANOG-1及shNANOG-2组细胞在不同时间点其光密度值(OD)较空白对照组及阴性对照组下降,在培养72 h后为明显,实验组与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.001).细胞周期检测显示,shNANOG-1及shNANOG-2组细胞在G0/G1期细胞比例较空白以对照组及阴性对照组高(P＜0.001),但两组细胞在S期细胞比例较空白对照组及阴性对照组低(P＜0.01),而在G2/M期细胞比例在各组间差异无统计学意义(P＞0.05).实时定量PCR法证实shNANOG-1及shNANOG-2组细胞中TP53及CDKN1A基因表达上调,而MDM2及CCND1基因表达下调,实验组与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 NANOG在部分人类ALL细胞系中有表达,下调NANOG后可通过MDM2-TP53-CDKN1A通路抑制白血病细胞的增殖,并使细胞阻滞于G0/G1期.
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TALENs介导的Nanog基因表达下调对宫颈癌HeLa细胞恶性行为的影响
目的 研究Nanog表达下调对宫颈癌HeLa细胞恶性行为的影响.方法 通过基因编辑工具转录激活样效应器核酸酶(TALENs)介导Nanog下调表达,基因测序分析Nanog的突变情况;挑取单个细胞培养以筛选出Nanog明显下调表达的单克隆HeLa细胞;RT-PCR检测mRNA表达水平;Western blot检测蛋白表达水平;HeLa细胞的集落形成能力、侵袭性及耐药性分别通过集落形成实验、Transwell侵袭实验及药物敏感性实验检测.结果 TALENs成功介导Nanog基因突变并导致其下调表达,Nanog突变的单克隆HeLa细胞NanogmRNA和蛋白表达水平较野生型HeLa细胞均下调表达(P＜0.05).Nanog突变单克隆HeLa细胞相对于野生型HeLa细胞表现出明显减弱的侵袭、集落形成及化疗药物抵抗能力(P＜0.05).结论 Nanog突变减弱HeLa细胞的恶性行为,下调或沉默Nanog表达有望成为一种新型的治疗宫颈癌策略.
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不同迁移能力肝癌细胞中干细胞相关基因Nanog、Sox2和Oct4的表达
目的:观察Nanog、Sox2和Oct4干细胞相关基因在四株不同迁移能力肝癌细胞系中的表达.方法:常规细胞培养无迁移能力的HepG2细胞、低迁移能力的MHCC97-L细胞、中迁移能力的LM3细胞及高迁移能力的MHCC97-H细胞,采用免疫荧光组织化学方法观察四株肝癌细胞系中肝癌干细胞相关基因Nanog、Sox2和Oct4的表达.结果:干细胞相关基因Nanog、Oct4和Sox2在四株迁移能力不同的肝癌细胞系中不同程度表达,且在细胞膜、细胞核、细胞浆中的表达量亦不同；Nanog在细胞核表达,并随着细胞迁移能力增强而呈递增趋势；Sox2在不同迁移能力肿瘤细胞中表达无明显规律,而Oct4在高迁移能力肝癌细胞的细胞浆及核中高表达.结论:Nanog、Sox2和Oct4在不同迁移能力肝癌细胞系中均有表达,但无明显规律,推测肝癌干细胞与肝癌的发生可能有密切关系.
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慢病毒载体介导Nanog小分子干扰核糖核酸抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长
目的 构建对Nanog基因有干扰作用的慢病毒载体,探讨其在人胃癌细胞SGC-7901裸鼠移植瘤模型中的表达,检测其对裸鼠移植瘤生长的影响.方法 将前期细胞实验验证有效的siRNA序列构建于慢病毒载体中,制备携带shRNA-Nanog的慢病毒,同时构建胃癌裸鼠移植瘤模型.以lentivirus-shRNA-Nanog感染的裸鼠作为实验组(目的组),以无关序列慢病毒感染的裸鼠(空载体组)及未感染的裸鼠(未感染组)作为对照组,测量肿瘤瘤体体积及质量的变化;活体荧光成像观察总荧光强度及转移情况,Western blot法检测移植瘤组织中Nanog蛋白的表达情况;TUNEL法观察其对皮下移植瘤细胞凋亡的影响.结果 经基因测序鉴定,Nanog基因shRNA重组慢病毒表达载体构建成功.活体荧光成像显示感染27 d后,目的组小鼠肿瘤总荧光强度明显低于空载体组和未感染组,裸鼠移植瘤瘤体积及瘤质量小于未感染组及空载体组;Western blot法显示目的组Nanog蛋白表达较对照组明显降低;TUNEL结果显示目的组凋亡指数较对照组明显增大,而空载体组与未感染组比较,差异无统计学意义.结论 成功构建了Nanog基因shRNA表达载体并包装成慢病毒颗粒,在体内感染能明显抑制肿瘤生长.
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shRNA抑制Nanog基因的表达对胃癌细胞SGC-7901分子生物学行为的影响
目的:利用RNA干扰技术构建并筛选出对Nanog基因有抑制作用的重组质粒pshRNA -Nanog,转染入胃癌细胞SGC-7901中,检测其对Nanog表达的影响及其对胃癌细胞SGC-7901的增殖、周期、凋亡以及迁移的影响.方法:构建出针对人Nanog基因构建出的干扰质粒pshRNA-Nanog,在脂质体的介导下将其转染胃癌细胞SGC-7901,通过荧光显微镜,RT-PCR和Western blot法检测其表达,筛选出抑制率高的一组；将筛选出的转染效率高的一组pshRNA-Nanog重组质粒转染胃癌细胞SGC-7901中,通过CCK-8检测其胃癌细胞SGC-7901增殖情况,流式细胞仪分析SGC-7901周期变化和凋亡情况,Transwell迁移实验验证Nanog对SGC-7901的迁移能力以及侵袭实验验证Nanog对SGC-7901侵袭能力的影响.结果:成功构建并筛选出了对胃癌细胞SGC-7901干扰效果明显的一组重组质粒；细胞的增殖受到抑制,胃癌细胞侵袭能力及迁移能力减弱,细胞周期停滞在S期,细胞的凋亡明显增加.结论:Nanog基因与胃癌细胞的增殖能力、周期及凋亡、迁移和侵袭能力有密切的关系.
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Nanog基因的原核表达及抗体制备
目的:在大肠杆菌中表达Nanog融合蛋白,制备兔抗小鼠Nanog融合蛋白抗体.方法:从含小鼠Nanog基因的pNA992质粒中扩增出小鼠Nanog基因并插入pET-32a中构建pET-32a-Nanog重组表达载体,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,得到了Nanog融合蛋白,并经Histrap亲和层析柱纯化后,将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫细胞化学染色检测抗体特异性.结果:成功地构建了重组表达载体pET-32a-Nanog,经诱导获得了大量Nanog融合蛋白,其主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达到97％,经免疫的兔抗血清效价可达1∶32 000,并表现出较好的特异性.结论:成功地制备出高滴度、高特异性的兔抗Nanog融合蛋白抗体.
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人Nanog基因的克隆及其在COS-7L细胞中的表达
目的:克隆人Nanog基因,构建其真核表达载体,并观察其在哺乳动物细胞COS-7L中的表达.方法:利用HE293细胞的人基因组DNA为模板,以LA-PCR技术,扩增Nango的基因,定向克隆到带Flag标签的pCMV载体中,测序后,挑选序列正确的真核表达质粒pFlag-Nanog转染COS-7L细胞.用抗Flag标签的抗体,进行Western blot和间接免疫荧光染色法检测Nango蛋白的表达.结果:从人基因组DNA中克隆到序列正确的Nanog全长编码序列.所构建的Nanog质粒在COS-7L细胞中获得高效表达.结论:人Nanog基因的克隆、真核表达载体的构建及在COS-7L中的表达均获得成功,为进一步研究其功能,尤其是探讨其在神经干细胞中的作用奠定了基础.
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Nanog蛋白对前列腺癌雄激素剥夺治疗后进展速度的预测价值
目的 探讨前列腺癌Nanog基因的蛋白表达对雄激素剥夺治疗后进展的预测价值.方法 选择2009年9月至2014年7月南通大学附属医院泌尿外科收治的前列腺癌患者,共115例,所有入组患者病理确诊后接受雄激素剥夺治疗,免疫组化EnVision染色方法检测前列腺穿刺癌组织中Nanog蛋白表达,x2检验或Fisher精确概率检验分析临床病理因素与Nanog蛋白标记表达相关性,Nanog蛋白表达和传统临床病理因素分别进行单因素分析(Log-rank检验)和多因素分析(Cox比例风险模型).结果 Nanog蛋白表达与传统临床病理因素相关性分析发现治疗前PSA水平与Nanog蛋白水平相关.单因素生存分析和Cox比例风险模型多因素分析发现Nanog蛋白表达是雄激素剥夺治疗后进展的独立影响因素.结论 Nanog蛋白表达对前列腺癌雄激素剥夺治疗后进展速度有一定的预测价值.
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结直肠癌肿瘤干细胞标志物的研究进展
肿瘤干细胞与恶性肿瘤复发、耐药等生物学过程密切相关,是治疗恶性肿瘤的新靶点.寻找稳定性高、特异性强、实用性好的肿瘤干细胞标志物,清除恶性肿瘤中的肿瘤干细胞有望彻底根治恶性肿瘤.本文综述了结直肠癌中比较公认的肿瘤干细胞标志物CD44和潜在的肿瘤干细胞标志物LGR5、Bmi1、SOX2、Nanog的研究进展,为靶向治疗结直肠癌提供了参考依据.
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OCT4、SOX2和Nanog在宫颈癌中的表达及其临床意义
目的:研究OCT4、SOX2和Nanog基因在宫颈癌中的表达及其临床意义.方法:采用免疫组织化学方法和免疫放射测定法检测61例宫颈癌组织中OCT4、SOX2、Nanog和血清中鳞状上皮细胞癌抗原(SCC-Ag)的表达情况.结果:OCT4、SOX2和Nanog在宫颈癌组织中呈高表达,OCT4、SOX2和Nanog的表达与FIGO分期和阴道切缘等密切相关,并且OCT4、SOX2和Nanog的表达与血清中SCC-Ag的水平呈正相关.结论:OCT4、SOX2和Nanog高表达与宫颈癌具有明显相关性,且与临床相关参数密切联系,OCT4、SOX2和Nanog可能作为宫颈癌诊断、预测及评估疗效的判定指标之一.
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干细胞标志物Nanog,p63和CD44s在皮肤基底细胞癌组织中的检测
目的 探讨干细胞标志物Nanog,p63和CD44s在皮肤基底细胞癌(BCC)组织中的表达情况.方法 采用免疫组化SP法检测干细胞标志物Nanog,p63和CD44s在30例基底细胞癌和10例正常皮肤组织中的表达.结果 Nanog细胞膜着色,在BCC中弱表达,正常皮肤不表达,两组间差异有统计学意义(P＜0.05).p63细胞核着色,在BCC和正常皮肤中均有表达,BCC中强表达,两组间表达p63的强度差异有统计学意义(P ＜0.005).CD44s细胞膜着色,在BCC中极少表达,正常皮肤中表达,两组间差异有统计学意义(P＜0.005).结论 干细胞标志物Nanog,CD44s和p63在BCC中具有不同程度的表达.
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NANOG在肝细胞癌中的表达及意义
目的 探讨NANOG在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)癌组织中的表达,并通过下调肝癌MHCC-97H细胞中NANOG的水平观察其对MHCC-97H细胞侵袭和迁移能力的影响.方法 收集89例HCC组织及对应的癌旁组织,应用免疫组化检测NANOG蛋白在肝癌及对应癌旁组织中的表达,并分析其表达与肝癌临床病理特征的关系.采用小干扰RNA(siRNA)下调肝癌MHCC-97H细胞中NANOG水平,Transwell实验检测MHCC-97H细胞的侵袭及迁移能力.结果 NANOG在肝癌组织中表达水平显著高于相应癌旁组织;肝癌组织中NANOG高表达与肿瘤大小、TNM分期、门静脉侵犯及Edmondson分级显著相关;NANOG高表达患者3年生存率明显低于低表达组;特异性siRNA下调NANOG水平后,明显抑制MHCC-97H细胞的侵袭和迁移.结论 NANOG在肝癌组织中的表达上调并与肝癌恶性临床病理特征有关,下调NANOG明显抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力.
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干细胞标志Nanog在食管鳞癌组织中表达及预后关系
目的：探讨食管鳞癌组织中干细胞标志Nanog表达及其与肿瘤病理特征和预后的关系。方法采用免疫组化方法测定60例食管鳞癌组织和10例癌旁组织中干细胞标志Nanog的表达情况,比较它在组织中的表达差异,及其与食管癌相关临床病理特征和预后的关系。结果在60例患者中,26例出现复发转移,Nanog在转移组中表达率分别为61.5%(16/26),在非转移组中分别为26.5%(9/34),差异有统计学意义,值<0.05。食管鳞癌原发灶分化程度不同,Nanog表达存在差异,但是同T和N分期没有明显的相关性(>0.05)。Nanog为阳性表达其转移率显著高于为阴性表达者。结论食管鳞癌组织中Nanog表达与患者术后复发转移有一定关系,该检测有助于预后的评价。
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胚胎干细胞因子Nanog、Oct4、Sox2与多囊卵巢综合征的相关性
目的 探讨颗粒细胞中胚胎干细胞因子Nanog、Oct4、Sox2与多囊卵巢综合征(PCOS)发生的关系.方法 选择接受体外受精/卵胞质内单精子注射-胚胎移植术(IVF/ICSI-ET)治疗的PCOS患者40例,同期输卵管因素或男方因素不孕患者40例作为对照组.利用Real time-PCR技术检测颗粒细胞中Nanog、Oct4、Sox2以及抗苗勒管激素(AMH) mRNA的表达水平,并用Western blotting分析蛋白表达水平与PCOS发生的关系.结果 PCOS组体质量指数(BMI)[(26.44±3.46) kg/m2]、黄体生成素(LH)[(7.56±0.98) IU/L]、LH/卵泡刺激素(FSH)(1.06±0.15)及获卵数(28.7±3 9)较对照组[(22.43±3.17) kg/m2、(4.26±0.34) IU/L、0.57±0.04、15.1±2 0]有显著升高(P均＜0 05).Real time-PCR结果显示,PCOS组胚胎干细胞因子Nanog (0.60±0.09)和Oct4 (0.85±0.14) mRNA表达水平显著低于对照组(1.65±0.17,1.59±0.17)(P＜0.05),AMH转录水平(1.28±0.11)显著高于对照组(0.89±0.07)(P＜0.05).Logistic同归分析结果显示,Nanog是PCOS发生的危险因素(OR=26.577,P=0.002),且Nanog与BMI、获卵数及AMH呈显著负相关(n=0.415,P=0.023;n=-0.415,P=0.022;r=-0.373,P=0.043),与Oct4呈显著正相关(r=0.684,P＜0.01).Western blotting结果显示,与对照组比较,PCOS组Nanog蛋白表达降低,AMH蛋白表达水平增高.结论 PCOS卵巢颗粒细胞中胚胎干细胞因子Nanog以及AMH的异常表达可能参与了PCOS的发生并影响卵母细胞的发育与成熟,为PCOS的临床治疗提供理论依据.
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小干扰RNA沉默胚胎生殖细胞Nanog基因的表达
目的:建立胚胎生殖细胞中沉默多能干细胞特异转录因子Nanog表达的方法.方法:通过检测碱性磷酸酶、SSEA-1和Oct4标志蛋白,鉴定体外培养的胚胎生殖细胞(EG细胞),通过脂质体介导作用,将Nanog特异性小干扰RNA(siRNA)转染EG细胞,应用半定量RT-PCR检测转染24 h、36 h、48 h后EG细胞中Nanog mRNA的表达水平,并应用免疫荧光技术检测转染36 h、48 h后EG细胞中Nanog蛋白的表达水平.结果:培养细胞具有高度碱性磷酸酶活性,SSEA-1、Oct4阳性,为保持未分化状态的EG细胞.转染后Nanog mRNA和蛋白表达均受到抑制.结论:脂质体介导siRNA能有效沉默EG细胞中Nanog基因的表达,为进一步探讨Nanog对胚胎生殖细胞的调控机制奠定了基础.
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胶质瘤组织中Nanog基因的表达及其意义
背景与目的:Nanog作为全能性或多能性干细胞标志物,在胶质瘤中的研究甚少.本研究探讨Nanog基因在不同病理级别胶质瘤组织中的表达及其意义.方法:采用免疫组织化学染色法和逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)方法从蛋白和mRNA水平检测50例不同病理级别胶质瘤组织和7例正常脑组织标本中Nanog的表达.结果:Nanog蛋白在胶质瘤组织WHOⅡ级、Ⅲ级、Ⅳ级的阳性率分别为(18.3±9.6)%、(37.9±19.0)%、(53.4±19.8)%,差异有统计学意义(F=14.918,P=0.000);Nanog mRNA的相对含量在胶质瘤组织WHOⅡ级、Ⅲ级、Ⅳ级中分别为0.1824±0.0310、0.3730±0.0961、0.4594±0.0453,差异有统计学意义(F=65.901,P=0.000),Nanog蛋白和mRNA表达强度随着病理级别增高而升高,而在正常脑组织中均未见表达.结论:Nanog在胶质瘤组织中高表达.其表达强度与病理级别密切相关,为进一步研究其与肿瘤干细胞关系及其在胶质瘤的生物学行为中所发挥的作用奠定了基础.
