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蛋白激酶B信号通路的干预在慢性脑低灌注大鼠中的作用及对海马细胞凋亡的影响
目的 探讨蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β(Akt/GSK3β)信号通路是否参与慢性脑低灌注(CCH)大鼠海马细胞凋亡过程.方法 选择SD大鼠60只,随机分为假手术组、CCH组、LY294002组、胰岛素样生长因子1(IGF-1)组,每组15只,后3组制作大鼠CCH模型,LY294002组和IGF-1组分别以抑制剂LY294002及激动剂IGF-1进行干预.采用TUNEL检测海马细胞凋亡;Western blot法检测Akt、GSK3β、磷酸化Akt (P-Akt)和磷酸化GSK3β(P-GSK3β)表达.结果 与假手术组比较,CCH组、LY294002组及IGF-1组细胞凋亡水平均升高(P＜0.05);与CCH组比较,LY294002组细胞凋亡数明显增高(20.33±1.52 vs 15.00±1.00,P＜0.05),而IGF-1组细胞凋亡数降低(12.00±1.73 vs 15.00±1.00,P＜0.05).与假手术比较,CCH组和IGF-1组P-Akt,P-GSK3β均明显增高(P＜0.05),而LY294002组无明显变化(P＞0.05);与CCH组比较,IGF-1组P-Akt,P-GSK3β表达量均升高(P＜0.05);LY294002组均降低(P＜0.05).结论 Akt/GSK3β信号通路参与CCH大鼠海马细胞凋亡过程,上调该通路Akt与GSK3β这2种蛋白的磷酸化表达水平,可能是拮抗这种细胞凋亡方式之一.
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胰岛素样生长因子和氯沙坦联合治疗心肌梗死的分子机制研究
目的 探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)基因转染和氯沙坦联合治疗大鼠急性心肌梗死及其机制.方法 构建IGF-1基因的腺病毒重组体(ADV IGF-1),结扎30只大鼠冠状动脉左前降支,造模急性心肌梗死后,随机分为对照组、腺病毒空载体(ADV)组、ADV-IGF-1组、氯沙坦组和ADV-IGF-1加氯沙坦联合治疗组(联合组),每组6只.后3组在心肌梗死周边区域注射1011 pfu/ml ADV-IGF-1 0.1 ml和(或)以氯沙坦10 mg/(kg·d)灌胃连续1周,1周后,ELISA法测心肌血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)蛋白含量变化;实时荧光定量PCR法检测心肌p53、Ang Ⅱ受体、IGF-1、Bcl-2基因表达;Western blot法检测心肌IGF-1蛋白表达.结果 与对照组和ADV组比较,ADV-IGF-1组心肌p53、AngⅡ受体基因表达明显降低,AngⅡ蛋白含量明显降低(P＜0.05);氯沙坦组明显上调心肌IGF-1基因表达(P＜0.05);联合组p53、AngⅡ受体基因弱表达,Bcl-2强表达(P＜0.05).结论 心肌梗死后,心肌特异性过表达IGF-1,下调p53基因表达,继而抑制AngⅡ受体基因表达和AngⅡ产生;氯沙坦干预促进IGF-1基因表达;IGF-1基因转染和氯沙坦联合治疗心肌梗死有协同作用.
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胰岛素样生长因子在急性颅脑创伤后作用机制的实验研究进展
颅脑创伤(traumatic brain injury,TBI)已成为严重威胁人类健康的疾病之一.我国的TBI发病率为(100～200)/10万人,其中重型TBI患者占18％～20％,其死亡率占30％～50％.至今我国TBI所致的死亡率仍处于居高不下的态势,伤残人数也在不断增加,这对人类的健康和生命安全构成巨大威胁,对社会劳动力和人口质量造成相当严重的影响.TBI可由直接或间接暴力所致,脑组织创伤又可分为原发性创伤和继发性创伤[1].继发性损伤包括:谷氨酸毒性、线粒体损伤、氧自由基损伤、内质网应激、细胞因子释放引起的炎症、内分泌障碍、脑缺血/缺氧、脑水肿、颅内压升高、钙超载、细胞骨架蛋白水解及突触生理功能的改变等,终导致神经元死亡[2-6].
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热量限制与沉默信息调节因子2相关酶1
热量限制是指一种有计划地减少由食物供给的热量,一般是在保证足够的维生素和矿物质水平下,将正常自由进食的热量减去30%～50%.1935年,McCay等首先报道热量限制能延长大鼠的生命,随后关于酵母、线虫、鱼、蜘蛛和哺乳动物等的诸多研究证实热量限制能够延长生命,大量实验已表明,热量限制是除遗传操作以外强有力的延缓衰老的方法,可使个体寿命延长高达到50%.大鼠海马沉默信息调节因子2相关酶(silent information regulator two protein,SIRT)1表达水平的降低与老化有关,热量限制可使其升高,但具体机制不明确[1].热量限制是多种动物中减慢老化和延缓衰老相关疾病的有力的干预手段.在哺乳动物中热量限制提高健康和延长生命的机制复杂,仍未完全阐述,但热量限制的一些作用可能通过SIRT1介导[2].我们对热量限制与SIRT1的关系进行综述.
关键词： 热量限制 胰岛素样生长因子Ⅰ 转录因子 长寿 沉默信息调节因子2相关酶 -
阻塞性睡眠呼吸暂停综合征与胰岛素样生长因子Ⅰ的关系研究
阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)是一种临床常见的疾病,发病率高.临床以反复的上气道阻塞导致低通气和窒息为特点,典型者在一个晚上的睡眠期间可以出现100~600次低通气事件,同时伴有睡眠中频繁觉醒,导致睡眠片段化.病情严重者可以导致死亡[1].流行病学研究表明,睡眠期低通气重要的危险因素是肥胖和男性.据统计,有7%的男性存在OSAS,而且在高龄人群中其发病率仍在上升[2].OSAS与日间思睡、反应能力下降、生活质量降低、工业劳动和交通事故危险性增加有关[3].
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抗衰老klotho基因的研究新进展
klotho基因是从模型小鼠中发现并命名的.该基因通过编码两种类型的蛋白发挥抗衰老作用.同时研究发现,klmho基因单核苷酸多态性与衰老性疾病的发生密切相关.1 klotho基因的结构特征和表达特性klotho基因定位于13q12,基因全长50 kb,含有4个内含子和5个外显子,启动子区域无典型的TATA盒或CAAT盒,而是存在5个SP1结合位点(小鼠存在4个SP1结合位点).
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冠状动脉旁路移植术后血栓形成和再狭窄影响因素的研究现状
冠状动脉旁路移植术(CABG)后,每年有4％～8％的患者可能再次出现心绞痛等心肌缺血症状,血栓形成和再狭窄是其主要原因之一.CABG同时损伤冠状动脉和旁路血管,血流动力学发生紊乱,表现为血管舒张或血管收缩减弱,引起内皮细胞缺乏和吻合口局部血栓形成,同时血管平滑肌细胞的增生使局部内膜增厚,这是形成旁路血管内膜迁移和增生以及导致粥样硬化的基础.再狭窄是一个复杂的生物学过程,血管内皮细胞的损伤破坏了在维持血管正常结构与生物学功能所起的重要作用,并诱发血管痉挛、炎症和血栓形成,内皮细胞覆盖程度与脱落细胞面积,直接关系到内膜增生及血运重建术后近、远期通畅率.因此,急性血栓形成、新生内膜增生和动脉粥样硬化,损害了冠状动脉和外周静脉旁路移植物的长期通畅性.此外,在导致移植物变性以至终移植失败过程中,通过黏附分子对白细胞-内皮的相互调节;在内皮型一氧化氮合酶和诱导型一氧化氮合酶的表达与活性中,一氧化氮继发信号的改变;随着促炎症作用的环氧化酶2活性增强,环氧化酶功能的变化;蛋白激酶C和丝裂原活化蛋白激酶信号的改变;表达血管渗透性和脆性的血管内皮生长因子的增加,均起到了重要作用[1].我们对近年来此领域的研究进展及现状进行综述.
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血清中胰岛素样生长因子-1水平与脑卒中后痴呆关系的研究
目的 研究血清胰岛素样生长因子-1(IGF-1)水平与脑卒中后痴呆(post-stroke dementia,PSD)的关系.方法 同期选择脑卒中患者129例作为脑卒中组,其他疾病患者76例为对照组,健康老年人41例为正常组.6个月后将脑卒中组患者按其是否符合痴呆诊断标准又分为PSD组(65例)和非PSD组(64例),发病时及6个月后测血IGF-1及认知功能量表测定.结果 脑卒中组IGF-1水平比对照组低,差异无显著性意义(t=-1.88,P=0.06),与正常组比较,则差异有显著性意义(t=-2.79,P=0.006);PSD组IGF-1水平比其他3组均低,4组间组内比较,差异有显著性意义(F=3.43,P=0.013);发病6个月后,PSD组IGF-1保持较低水平;logistic回归方程发现与PSD相关的危险因素包括年龄、收缩压、IGF-1及冠心病、高血压.相关分析发现血IGF-1水平与一般认知功能水平相关,其中空间结构能力、注意、短时记忆与瞬间记忆受影响比较明显(P＜0.05).结论 脑卒中发病时低IGF-1水平者,其发生PSD的可能性大;血IGF-1水平与认知功能存在一定的相关性.
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老年2型糖尿病患者胰岛素样生长因子1及胱抑素C与糖尿病肾病的关系
目的 研究血清胰岛素样生长因子1(IGF-1)水平及血清胱抑素C在2型糖尿病(T2DM)肾病患者的变化及临床意义.方法 根据尿白蛋白排泄率水平,将其分为单纯T2DM组63例,早期糖尿病性肾病(DN)组60例,临床期DN组65例,另选择60例健康体检者作为正常对照组(对照组).采用酶联免疫吸附法检测各组血清IGF-1及血清胱抑素C水平,电化学发光法检测尿白蛋白,再计算尿白蛋白排泄率.结果 与对照组比较,单纯T2DM组、早期DN组及临床期DN组IGF-1水平[(175.35±12.43)μg/L、(221.19±25.06)μg/L、(248.77±35.88)μg/L vs (136.86±28.32)μg/L]明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);早期DN组、临床期DN组IGF-1水平较T2DM组升高,差异有统计学意义(P＜0.05);早期DN组、临床期DN组血清胱抑素C水平较对照组、单纯T2DM组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).多元线性回归分析显示,尿白蛋白排泄率和胱抑素C是IGF-1的影响因素(P＜0.01).结论 IGF-1及血清胱抑素C与T2DM肾病的发生发展有显著相关性,是临床较为敏感的指标,具有早期提示意义.
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胰岛素样生长因子1诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究
目的 研究胰岛素样生长因子1(IGF-1)诱导骨髓间充质干细胞(BMSC)分化为心肌样细胞的能力及其机制.方法 分离大鼠BMSC,并在体外培养纯化.实验分为两个部分:第一部分,IGF-1诱导BMSC分化为心肌样细胞的实验研究,分为培养基对照组(对照组)和15 ng/ml的IGF-1诱导组(IGF-1组),连续培养21 d,分别在第3、7、14和21天采用免疫细胞化学染色法和Western blot法检测BMSC中磷酸化(p) IGF-1受体(R)、心肌特异性肌钙蛋白T(TNT)及肌钙蛋白I(TNI)的表达.第二部分为IGF-1R激酶阻断剂I-OMe AG538阻断IGF-1诱导BMSC向心肌样细胞分化的实验研究,分为培养基对照组(对照组)、15 ng/ml IGF-1诱导组(IGF-1组)、300 nmol/L I-OMe AG538阻断组(I-OMe AG538组)及300 nmol/L I-OMe AG538阻断+15 ng/ml IGF-1诱导组(I-OMe AG538+ IGF-1组).免疫细胞化学法和Western blot法检测BMSC中TNT及TNI、MAPK和PI3K信号通路的蛋白表达水平.结果 IGF-1诱导BMSC分化的实验结果显示IGF-1组诱导后,TNT、TNI的表达均呈阳性,pIGF-1R的表达量也明显高于对照组(上述因子均未检测到),以第14天为高(P＜0.05).I-OMeAG538作用BMSC 3和6h后,I-OMe AG538组pERK1/2/ERK1/2比值分别为0.17±0.03和0.06±0.03,均显著低于对照组的1.00±0.05(P均＜0.05).IGF-1组pAKT/AKT和pERK1/2ERK1/2的比值分别为1.00±0.07和1.00±0.09均显著高于对照组的0.72±0.05(P均＜0.05),而I-OMe AG538组pAKT/AKT和pERK1/2 ERK1/2的比值分别为0.31±0.10和0.39±0.04均显著低于对照组的0.63±0.05(P均＜0.05).I-OMe AG538+ IGF-1组心肌样细胞的TNT和TNI蛋白表达的灰度值分别为195.06±5.98和198.32±3.46均显著高于IGF-1组的188.70±5.35和176,10±4.96(P均＜0.05).IGF-1组IGF诱导BMSC 3、7、14和21 d后,其TNT、TNI和pIGF-1R的蛋白表达水平均高于对照组,且以第14天为高(P均＜0.05).结论 IGF-1诱导BMSC分化为心肌样细胞的佳诱导时间是14 d,诱导机制可能与MAPK和PI3K信号通路有关.
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生长激素对胰腺癌IGF-Ⅰ,Ⅱ-IGFBP3通路动态影响的实验研究
目的 观察生长激素(GH)对胰腺癌细胞增殖及对肿瘤宿主胰岛素样生长因子Ⅰ,Ⅱ(IGF-Ⅰ,Ⅱ)-胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)通路的影响,初步探讨体内外实验差异的原因.方法 体外应用GH(50 ng/ml)24 h,48 h,72 h后计数胰腺癌细胞SW-1990,PANC-1及P3;选用BALB/C雌性裸小鼠35只,以SW-1990成瘤,测量瘤体积,成瘤裸鼠随机分为注射GH的实验组(GH组)及对照组(NS组),荷瘤裸鼠在后依次注射GH后第1小时、2小时、6小时及24小时处死动物,心室穿刺抽血,切除肝脏,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IGF-Ⅰ,-Ⅱ水平(P＜0.05),蛋白印记(Western Blot)方法观察肝脏IGFBP3的相对光密度(ROD)变化.结果 GH在体外可加速胰腺癌细胞增殖但在体内不促进肿瘤生长;GH上调荷瘤宿主血清IGF-Ⅰ、Ⅱ水平;与GH刺激前(NS)相比,肝脏IGFBP3表达在GH刺激后1 h、2 h、6 h有显著提高(P＜0.05),24 h有所减弱.结论 GH对胰腺癌细胞的作用存在一定的体内外差异;GH在体内通过提高IGF-Ⅰ、Ⅱ水平发挥效应,GH不刺激在体肿瘤生长可能与IGFBP3上调有关.
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周期性应力下胰岛素样生长因子1受体对大鼠软骨细胞功能的影响
目的 探讨周期性机械应力条件下胰岛素样生长因子1型受体( IGF1R)对大鼠软骨细胞增殖及细胞外基质合成的影响.方法 体外分离培养大鼠软骨细胞,随机分为4组:加压0h组、加压0.5 h组、加压1 h组、加压2 h组,采用Western Blot法检测各组细胞IGF1R的表达及磷酸化水平,并在此基础上将同代无处理的软骨细胞在加压各组检测的同时给予同样检测即为静态组,应用Gel-Pro Analyzer软件进行半定量灰度分析比较各时间段静态和加压两两各组磷酸化 IGF1R/总IGF1R水平差异.另取大鼠软骨细胞随机分为静态组、加压对照组、IGF1R阻断组、加压后IGF1R阻断组,IGF1R阻断采用顺式-3-[8-胺基-1-(2-苯基-喹啉-7-基)-咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基]-1-甲基-环丁醇(OSI-906)或者以IGF1R shRNA两种方式.阻断IGF1R 1 h后Western Blot法检测各组细胞磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(ERK 1/2)表达及磷酸化水平;8 h后实时荧光定量PCR检测各组2型胶原(collagenⅡ)、蛋白聚糖(aggrecan)表达;3 d后采用直接细胞计数方式及细胞计数试剂盒(CCK-8)对软骨细胞增殖状况进行测定.应用SPSS 18 .0软件进行相关统计学分析,两组间差异采用t检验比较.结果 磷酸化IGF1R/总IGF1R蛋白水平在加压0 h组与静态组之间差异无统计学意义(t=0 .255, P=0 .811),而在0 .5 h组,1 h组,2 h组较相对应的静态组增高,差异具有统计学意义(t=-5 .881、-6.172、-10.518,P均小于0 .05). IGF1R被OSI-906或shRNA抑制后,加压处理的ERK 1/2磷酸化水平显著降低(OSI-906阻断后t=3 .074,shRNA阻断后t=3 .990,P均小于0.05),细胞外基质collagenⅡ(OSI-906阻断后t=3 .243, shRNA阻断后t=3 .621,均为P<0.05)、aggrecan(OSI-906阻断后t=3.128,shRNA阻断后t=3.608,P均小于0.05)基因表达水平显著降低,大鼠软骨细胞增殖能力减弱,差异均具有统计学意义(OSI-906阻断后t=2 .835、shRNA阻断后t=3.467,均为P<0 .05).结论 周期性机械应力通过压力感受器IGF1R将机械信号转变为生物化学信号,激活ERK 1/2信号通路促进软骨细胞增殖和细胞外基质合成.
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分泌IGF-1的间充质干细胞对肝脏缺血-再灌注损伤的保护作用
目的探讨分泌胰岛素样生长因子1的间充质干细胞(IGF-1-MSC)对小鼠肝脏缺血-再灌注损伤(IRI)的作用.方法50只C57BL/6系小鼠按随机数字表法随机分为IRI组、PBS组、MSC组、IGF-1-MSC组、对照组,各10只.建立小鼠肝脏IRI模型,缺血时间60 min,再灌注时IRI组不做处理,PBS组经门静脉注射PBS溶液100μl,MSC组经门静脉注射MSC细胞悬液100μl,IGF-1-MSC组经门静脉注射IGF-1-MSC细胞悬液100μl.检测AST、ALT、乳酸脱氢酶(LDH)水平,并行肝组织病理学检查及TUNEL染色.各组检测指标比较采用单因素分析和LSD-t检验或Kruskal-Wallis检验.结果再灌注后24 h,IGF-1-MSC组AST、ALT、LDH分别为(815±233)、(867±350)、(845±358)U/L,明显低于MSC组的(3805±1355)、(2421±845)、(2011±162)U/L(LSD-t=-4.865,-3.725,-6.637;P<0.05).IGF-1-MSC组肝窦轻度淤血,少量肝细胞凋亡;而IRI组肝细胞大量凝固性坏死和细胞凋亡.IGF-1-MSC组24 h肝组织损伤Suzuki评分为4(3~4)分,明显低于MSC组和IRI组的5(4~5)和8(7~10)分(Z=-2.545,-2.703,P<0.05).结论IGF-1-MSC输注能有效减轻肝脏IRI程度,减少肝细胞凋亡可能是其保护作用机制之一.
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高表达CXCL12、IGF1胃癌组织临床病理特征及预后分析
目的 探讨高表达CXCL12、IGF1胃癌组织临床病理特征及预后,为临床胃癌的诊断和治疗提供依据.方法 回顾性分析2012年3月至2015年3月81例进行手术切除的81例胃癌患者临床资料,采用免疫组织化学(IHC)方法检测患者癌组织与癌旁组织(距离癌组织1 cm)及正常组织中CXCL12与IGF1表达水平.数据以SPSS20.0统计分析,CXCL12与IGF1在不同胃组织中表达水平以例数(％)表示,采用χ2检验;使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,使用Log\rank法比较生存曲线之间的差异,以P<0.05为差异有统计学意义.结果 胃癌组织中CXCL12(53.1％)、IGF1(49.4％)表达水平明显高于癌旁组织(40.7％,39.5％)与正常组织(7.4％,8.6％),P<0.05;高表达CXCL12(中位生存时间为13个月)、IGF1(中位生存时间为17个月)胃癌患者生存时间明显较低表达(中位生存时间分别为64、65个月)患者,差异有统计学意义(P<0.05).结论 CXCL12、IGF1在胃癌中表达水平显著高于正常组织和癌旁组织,可能作为胃癌诊断的依据,高表达CXCL12、IGF1胃癌患者恶性程度较高、较易出现转移,患者预后较差.
关键词： 胃肿瘤 趋化因子CXCL12 胰岛素样生长因子Ⅰ 预后 -
术前口服葡萄糖溶液对结直肠肿瘤术后肠黏膜屏障功能的保护作用
目的 探讨术前口服葡萄糖溶液对结、直肠肿瘤术后肠道屏障功能及肠道功能恢复的影响.方法 将择期行结直肠肿瘤根治手术的40例患者按随机数据表法随机分为糖水组及禁食组.糖水组19例,于术前晚7～12时口服质量分数为12.5%的葡萄糖溶液800 ml,麻醉诱导前2小时再口服12.5%的葡萄糖溶液200 ml;禁食组18例,术前常规禁食8～12 h.手术采用气管插管静吸复合全麻加硬膜外麻醉维持,监测术前1天及术后第1、3、7天血浆内毒素浓度及血浆胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)浓度;比较两组术后开始排气及排便时间.结果 术后第1、3天糖水组血浆内毒素浓度(pg/ml)均低于禁食组(2.43±0.09 vs 2.83±0.56;2.55±0.39 vs 2.94±0.55,P<0.05);糖水组IGF-I水平(μg/L)于术后第1天高于禁食组(90.65±55.06 vs 55.72±26.39,P<0.05),差异均有统计学意义;糖水组排气、排便时间(h)均早于禁食组,分别为(59.82±13.88 vs 73.70±11.47)、(65.36±18.48 vs 86.64 ±10.12).P均<0.05.结论 术前口服葡萄糖溶液可保护结、直肠肿瘤切除术后的肠黏膜屏障功能,并促进患者早期排气排便,值得在临床推广.
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烧伤后铜绿假单胞菌感染对γδT细胞胰岛素样生长因子Ⅰ合成的影响
目的 探讨铜绿假单胞菌(PA)感染对烧伤患者外周血γδT细胞合成胰岛素样生长因子Ⅰ (IGF-Ⅰ)的影响.方法 以2012年3月至2013年7月在九七医院南京军区烧伤治疗中心治疗的87例烧伤患者及20名健康者为观察对象,统计患者的烧伤面积,抽取其在伤后2周及创面痊愈后的静脉血,伴有PA感染的患者还抽取感染期静脉血；健康者抽取清晨静脉血,用QuantibriteTM PEbead试剂盒检测标本γδT细胞IGF-Ⅰ的表达.根据是否感染PA,将烧伤患者分为感染组(n=8)及未感染组(n=79),比较烧伤面积与PA感染之间的关系；将健康者设为对照组,比较γδT细胞IGF-Ⅰ的表达在3组间的差异,并建立多元回归方程.结果 感染组的平均烧伤面积明显大于非感染组,即PA感染与烧伤面积关系密切,PA可减少烧伤患者外周血γδT细胞合成IGF-Ⅰ,两者之间的相关性显著(r=-0.906,P=0.017).以烧伤面积(X1)、PA感染(X2)作为自变量,以感染期γδT细胞IGF-Ⅰ合成水平为因变量作回归分析,得到多元线性回归方程:y=5.553+0.219XI-0.165X2.结论 PA抑制γδT细胞合成IGF-Ⅰ,这是烧伤创面愈合的不利因素.由于γδT细胞合成的IGF-Ⅰ在全身起作用,说明局部创面的PA感染能成为全身创面愈合的不利因素.
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铜绿假单胞菌密度感应信号分子OdDHL对γδT细胞合成胰岛素样生长因子1的影响
目的 探讨密度感应(QS)信号分子OdDHL在铜绿假单胞菌(PA)抑制外周血γδT细胞合成胰岛素样生长因子1(IGF-1)过程中所起的作用及其机制.方法 (1)分离纯化健康成人外周血γδT细胞,细胞同步后配成浓度为5×106个/mL的细胞悬液放入6孔培养板,每孔2 mL,按随机数字表法将培养板孔分为6组,每组设3个复孔,分别加入0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L浓度OdDHL各20μl,在37℃,5％ CO2培养箱中培养24 h.用WST-l细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测γδT细胞的活性,用Annexin V/PI双染检测试剂盒检测γδT细胞的凋亡.(2)分离纯化健康成人外周血γδT细胞,细胞同步后配成浓度为5×106个/mL的细胞悬液放入6孔培养板,每孔2 mL,按随机数字表法将培养板孔分为4组,阳性对照组和阴性对照组每组设3个复孔,剩余2组分为2个OdDHL浓度水平处理组,每组设5个复孔,阳性对照组加入终浓度为10 mg/L的Con A,阴性对照组加入相应体积的PBS.2个OdDHL处理组在加入终浓度为10 mg/L的Con A后分别加入25、50 μmol/L的OdDHL 20 μL.在37℃,5％ CO2培养箱中培养48 h.用ELISA法测定培养上清中IGF-1浓度,用实时荧光定量PCR测定γδT细胞TLR4 mRNA,用Western blot法测定γδT细胞TLR4蛋白,用流式细胞仪检测γδT细胞CD80、CD86的表达.对数据行F检验和q检验.结果 (1)OdDHL浓度达到100 μmol/L可明显抑制γδT细胞活性,提高细胞的凋亡,而低于50 μmol/L的OdDHL却对γδT细胞活性无明显影响.(2)培养上清中IGF-1在阴性对照组为(14.32±2.34) μg/mL,在阳性对照组为(139.58±11.73).μg/mL,在25 μmol/L的OdDHL处理组为(85.64±7.52) μg/mL,在50 μmol/L的OdDHL处理组为(56.49±4.93) μg/mL,统计学分析显示差异有统计学意义(F=296.69,P＜0.05).(3)γδT细胞TLR4 mRNA表达值在阴性对照组是0.91±0.13;在阳性对照组是5.07 ±0.72,在25 μmol/L的OdDHL处理组是3.36 ±0.45,在50 μmol/L的OdDHL处理组是1.56±0.21,统计学分析显示差异有统计学意义(F=107.98,P＜0.05).γδT细胞TLR4蛋白表达值在阴性对照组是0.52 ±0.09;在阳性对照组是2.27 ±0.51,在25 μmol/L的OdDHL处理组是1.14 ±0.17,在50 μmol/L的OdDHL处理组是0.78±0.15,统计学分析显示差异有统计学意义(F =41.86,P＜0.05).γδT细胞表面CD80表达率在阴性对照组是(3.92±0.49)％;在阳性对照组是(52.65±4.26)％,在25 μmol/L的OdDHL处理组是(23.04±2.53)％,在50 μmol/L的OdDHL处理组是(12.88±1.65)％,统计学分析显示差异有统计学意义(F=586.901,P＜0.05).γδT细胞表面CD86表达率在阴性对照组是(1.61±0.15)％;在阳性对照组是(22.03 ±3.17)％,在25 μmol/L的OdDHL处理组是(9.59±1.06)％,在50 μmol/L的OdDHL处理组是(5.76±0.95)％,统计学分析显示差异有统计学意义(F=231.126,P＜0.05).结论 PA分泌的QS信号分子OdDHL可通过促进细胞凋亡或抑制细胞激活来减少γδT细胞IGF-1的合成,影响全身烧伤创面的愈合.
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核酶阻断IGFⅠ及IGFⅠR表达抑制病理性瘢痕形成的研究
目的 研究胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)及胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGF-ⅠR)核酶抑制病理性瘢痕形成的作用.方法 选取100只SPF级4~6周龄裸鼠,另选取2015年5月至2016年7月暨南大学医学院附属广州市红十字会医院18例烧伤整形科住院患者手术切除的组织病理性瘢痕标本.将瘢痕组织体外培养成纤维细胞并分为a~g 7组,分别转染IGF-Ⅰ及IGF-ⅠR核酶后,检测培养基上清中羟脯氨酸含量.利用real-time PCR检测IGF-Ⅰ及IGF-ⅠR mRNA水平.将小鼠随机分成A~H 8组,每组10只,分别散点注射不同浓度IGF-Ⅰ及IGF-ⅠR核酶后,检测瘢痕增生组织体积大小,应用内参物竞争性PCR定量分析裸鼠瘢痕组织中Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA水平的改变.利用Western Immunoblotting法分析经处理后Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白水平的变化.结果 在成纤维细胞中转染不同浓度IGF-Ⅰ及IGF-ⅠR核酶后,上清中羟脯氨酸含量和IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR mRNA水平均有所降低.单独转染IGF-ⅠR核酶及单独转染IGF-Ⅰ核酶对IGF-ⅠR mRNA水平无显著影响.在人增生性瘢痕裸鼠动物模型中注射IGF-Ⅰ及IGF-ⅠR核酶后,裸鼠瘢痕组织体积减小,瘢痕增生组织中Ⅰ型前胶原mRNA水平和蛋白水平降低,Ⅲ型前胶原mRNA水平和蛋白水平均有所增高.结论 IGF-Ⅰ及IGF-ⅠR核酶可用于治疗病理性瘢痕形成.
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不同浓度胰岛素样生长因子-1和转化生长因子β-3对人肌腱细胞存活和胶原合成的影响
目的 为肌腱组织工程筛选出一种优化的人肌腱细胞培养基,即使在不添加胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的条件下,通过优化培养基构成维持其存活并分化.方法 在α-MEM培养基中,加入佳组合的生长因子(growth factors,GF),同时加入不同浓度的FBS(0、1％、5％和10％)和不同浓度的IGF-1(0、10、50 ng/ml),TGFβ-3 (0、1、10 ng/ml),用拉马拉蓝染色法检测人肌腱细胞的生存情况、增殖速度,用天狼星红定量胶原合成.结果 在无FBS情况下,含有10 ng/ml TGFβ-3和50 ng/ml IGF-1两种生长因子的α-MEM培养基中培养14 d后,人肌腱细胞依旧存活(6228.68±43.87),高于其他实验组,但低于10％ FBS对照组(13 576.74±286.75,t=41.29,P＜0.05),胶原合成量[ (0.322 ±0.003) ng]明显大于未添加生长因子组(t=4.13 ～5.93,P＜0.05).结论 添加50 ng/ml IGF-1和10 ng/ml TGF3-3优化的α-MEM培养基可维持人肌腱细胞存活长达14 d并促进肌腱细胞分化,而不必添加FBS.
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内毒素血症状态下生长激素不敏感的实验研究
目的探讨内毒素血症状态下生长激素不敏感的发生机制. 方法采用雄性SD大鼠(n=180),静脉分别注射内毒素(LPS)、TNF-α及IL-6,部分注射LPS大鼠同时皮下注射生长激素(GH),不同时相处死大鼠.应用RT-PCR法测定肝组织胰岛素样生长因子Ⅰ(IGFⅠ)、生长激素受体(GHR)和细胞因子信号抑制子3(SOCS-3) mRNA的表达;应用RIA测定血清GH水平;应用ELISA测定血清TNF-α和IL-6水平. 结果静脉注射LPS后各时相血清GH水平无明显变化,但肝组织IGFⅠ和GHR mRNA的表达却明显下调,多分别达53%和89%.正常大鼠肝组织SOCS-3 mRNA微弱表达,但内毒素血症鼠其表达却明显上调,高达7.84倍.大剂量LPS注射诱导更多GHR mRNA表达下调和SOCS-3 mRNA表达上调.GH可使正常鼠肝组织IGFⅠ mRNA的表达上调25%,但与LPS同时注射则不能阻止IGFⅠ mRNA表达的下调.LPS刺激TNF-α和IL-6的产生,且升高的IL-6水平与SOCS-3 mRNA表达上调成高度正相关.静脉注射TNF-α主要使肝组织GHR mRNA表达下调,而 IL-6主要使肝组织SOCS-3 mRNA表达上调. 结论静脉注射LPS可以诱导生长激素的不敏感,该不敏感可能与GHR mRNA表达下调和SOCS-3 mRNA表达上调有关,TNF-α和IL-6可能从不同方面介导了LPS的部分生物效应.
