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原代大鼠脑微血管内皮细胞的培养及鉴定
目的:建立一种纯度较高的原代大鼠脑微血管内皮细胞的分离培养方法.方法:取7～10日龄SD大鼠脑组织,经匀浆,牛血清白蛋白密度梯度离心,Ⅱ型胶原酶消化获得脑微血管段后,置于CO2培养箱中进行原代培养.通过细胞形态学观察、第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色鉴定所培养的细胞.结果:在倒置显微镜下,体外培养24～48 h后,细胞从贴壁的脑微血管段周围爬出,单个细胞为短梭形或多角形,呈团簇状单层贴壁生长,待细胞密集融合后,则成典型的“铺路石样”涡旋状排列;Ⅷ因子免疫细胞化学染色检测,相关抗原表达为阳性,细胞胞质显棕黄色,阳性细胞率达99％以上.结论:该方法能够成功分离培养出原代大鼠脑微血管内皮细胞.
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缺氧对血脑屏障细胞分泌组织型纤溶酶原激活物的影响
目的:探讨缺氧对体外培养鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞分泌组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator,TPA)的影响.方法:分别对新生小鼠脑微血管内皮细胞、星状胶质细胞进行缺氧条件下培养,常规培养作为空白对照,每组各取8例,吸取培养液用酶联免疫吸附试验测试TPA活性.结果:缺氧后内皮细胞TPA活性明显增高(P＜0.01),星形胶质细胞TPA活性无明显变化(P＞0.05).结论:体外培养鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞均能合成分泌TPA;缺氧状态下脑微血管内皮细胞产生的TPA活性增高.内皮细胞分泌的TPA是脑缺氧缺血致不可逆神经元损伤的一个重要媒介,而星形胶质细胞分泌的TPA则主要参与发育阶段需要细胞迁移的重建活动.
关键词： 缺氧 微血管内皮细胞 星形胶质细胞 组织型纤溶酶原激活物 -
血管内皮细胞凋亡与功能的生物力药理学调节
为探讨川芎嗪和剪应力对血管内皮细胞凋亡的影响,以锥一板旋转式剪切装置提供剪应力,与川芎嗪共同作用于大鼠微血管内皮细胞(rCMECs),采用Annexin V-FITC染色标记,利用全内反射衰逝波激发ICCD成像技术,探测川芎嗪和剪应力对rCMEC磷脂酰丝氨酸(PS)异位的影响.结果表明,培养内皮细胞膜表面PS异位具有普遍性,静态培养内皮细胞的PS异位率(异位程度)为9.97%.作为单因素,剪应力(6、12、24dyn/cm2)或川芎嗪(31.5,63.0,126.0μg/ml)均可使PS异位率明显下降(P＜0.001).在同一剪应力水平条件下,川芎嗪的给予可使内皮细胞的PS异位率进一步降低.中等水平的两因素组合降低异位率的效果较突出.结果提示,适当水平的剪应力与川芎嗪联合作用有可能明显抑制内皮细胞凋亡.
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动脉粥样斑块新生血管的影像学研究进展
新生血管是指原有微血管内皮细胞经过生芽、迁移、增殖与基质重塑等过程而产生的新血管,成年人生理性的新生血管仅见于月经期和哺乳期的女性生殖器官.近年来大量研究表明内膜新生血管是动脉粥样硬化疾病普遍存在的特征,它是动脉粥样硬化发生发展的重要危险因素,而且新生血管在不稳定性斑块及斑块的易损部位更为明显,与临床心脑血管事件的发生显著相关 [1].因此应用影像学技术评估斑块内新生血管,在辨识斑块稳定性,监测临床治疗疗效,预测心脑血管意外的发生及早期预防等方面具重要作用.但目前对斑块内新生血管的影像学检查还并不完善,主要包括超声、CT、MRI及放射性核素显像.近年来分子影像学(molecular imaging)技术越来越受到重视,它可在活体状态下反映分子水平变化情况,并进行定性定量分析,国内外已应用该技术对斑块内新生血管进行了初步的研究.
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Apelin经Akt/AMPK信号通路促进心肌微血管内皮细胞血管生成
目的:探讨apelin-13对大鼠心肌微血管内皮细胞(MVECs)的生物学效应及其可能的信号通路. 方法:体外培养大鼠的心肌微血管内皮细胞.给予不同浓度apelin-13,采用MTT法观察细胞增殖能力、划痕损伤修复和Transwell方法观察细胞迁移能力、体外管腔样结构形成方法观察细胞管腔成能力.进一步采用蛋白印迹法观察apelin-13对Akt和AMPK分子蛋白的磷酸化水平的影响. 结果:Apelin-13能增加大鼠微血管内皮细胞的增殖、迁移和体外管腔形成能力,且呈剂量依赖性在200 nmol/L浓度时促血管生成能力佳.Apelin-13能上调细胞的Akt和AMPK磷酸化程度. 结论:Apelin-13可促进MVECs的血管生成,可能与上调Akt和AMPK的磷酸化相关.
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AGEs诱发大鼠心脏微血管内皮细胞eNOS脱偶联
目的:观察牛血清白蛋白糖基化终末产物(BSA-AGEs)诱导心脏微血管内皮细胞内一氧化氮(NO)生成与内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的变化及相关性.方法:体外原代培养大鼠心脏微血管内皮细胞,采用不同梯度浓度的BSA-AGEs (50～200 mg/L)分别作用0～24 h,检测NO与超氧阴离子(O2-)、eNOS蛋白表达和四氢生物喋呤(BH4)含量. 结果:随着AGEs浓度增加及作用时间的延长,心脏微血管内皮细胞中O2-生成增多,NO生成减少,eNOS蛋白表达增加；BH4生成减少(P＜0.05). 结论:BSA-AGEs可以诱发心脏微血管内皮细胞eNOS脱偶联的发生,从而引发以微血管内皮功能障碍.
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鞭毛蛋白致肺微血管内皮细胞炎症诱发共培养肺泡上皮细胞炎症的级联放大效应与信号传导通路
目的 探讨鞭毛蛋白感染后炎症级联放大效应与信号传导通路.方法 建立Transwell共培养体系,将人肺微血管内皮细胞株(human pulmonary microvascular endothelial cells,HPMECs)接种于Transwell小室的下层,培养2h后,将人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549细胞株接种于小室的上层与HPMECs共培养15 d.实验分为3组:HPMECs与A549细胞共培养空白对照组、鞭毛蛋白(2μg/mL)感染HPMECs再与A549细胞共培养组(实验组Ⅰ)、HPMECs加DAPT(Notch信号阻断剂,终浓度10 μmol/L)预处理再行鞭毛蛋白感染与A549细胞共培养组(实验组Ⅱ).用ELISA法检测各组HPMECs和A549细胞培养上清液TNF-α蛋白表达,检测HPMECs上清液Notch1蛋白表达水平.结果 与共培养空白对照组比较,鞭毛蛋白感染HPMECs后,共培养HPMECs和A549细胞上清液TNF-α蛋白[(11.45士1.59) pg/mL vs (6.13±0.86) pg/mL,(P＜0.01)、(9.93土1.46) pg/mL vs (5.89±0.83) pg/mL,(P＜0.01)]和HPMECs上清液中Notch1蛋白[(7.03±1.06) pg/mL vs(5.39土0.76)pg/mL,(P＜0.05)]表达水平皆明显升高,提示鞭毛蛋白引起HPMECs炎症,且向A549细胞传导级联放大,而HPMECs使用Notch信号阻断剂处理后,HPMECs上清液Notch1蛋白表达水平明显降低[(3.78±0.53) pg/mLvs (7.03±1.06) pg/mL,(P＜0.01)],共培养A549细胞上清液TNF-α蛋白表达水平也显著下降[(7.47土1.05) pg/mL vs(9.93土1.46)pg/mL,(P＜0.05)],表明HPMECs炎症反应经过Notch信号通路传导向A549细胞级联放大.结论 鞭毛蛋白感染肺微血管内皮细胞能引起炎症反应,并可能经过Notch信号通路传导向肺泡上皮细胞级联放大.
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脂肪来源干细胞的可塑性
脂肪组织为中胚层来源,其中含有成熟的脂肪细胞和未分化的脂肪干细胞,以及微血管内皮细胞和少量的平滑肌细胞.具有干细胞特点的脂肪干细胞可以通过酶消化及离心等方法,从脂肪组织中分离获得.
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血-神经屏障的研究进展
血-神经屏障(blood-nerve barrier,BNB)是一种类似血-脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的屏障系统,选择性地限制血液和周围神经系统之间的物质交换.BNB在神经病变中会出现通透性等方面的改变,深入了解BNB对于治疗此类疾病具有重要意义.本文从BNB的结构和功能、细胞生物学研究进展、BNB在病理情况下的改变及意义,以及BNB与药物作用之间可能存在的联系等方面作一综述.
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胰高血糖素样多肽1抑制高糖诱导的高迁移率组蛋白B1表达及机制研究
目的 研究胰高血糖素样多肽1(glucagon like peptide 1,GLP-1)对高糖环境下培养的人视网膜微血管内皮细胞(human retinal capillary endothelial cells,HRCEC)中,高迁移率组蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)表达的影响及相关机制.方法 高糖刺激HRCEC不同时间(24h、48 h及96 h)后,分别使用不同浓度的GLP-1(10 mmol/L、100 nmol/L及1 000 nmol/L)刺激HRCEC 96h后,分别通过RT-PCR、ELISA及Western Blot检测HMGB1的mRNA、分泌及蛋白水平.使用高糖和GLP-1刺激细胞1h后,Western Blot检测HMGB1表达相关信号通路(p38 MAPK、JNK和NF-κB)磷酸化水平.结果 相较于正常糖水平,高糖促使HMGB1的mRNA、分泌及蛋白水平显著升高,GLP-1可有效抑制这一效应.高糖可显著性激活p38 MAPK、JNK和NF-κB,而GLP-1则抑制高糖所诱导的这些信号通路激活.结论 GLP-1可能通过抑制高糖刺激下HMGB1的表达及炎症信号通路激活,从而抑制糖尿病视网膜病变的发生及发展.
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清活Ⅰ号中药复方对高糖培养微血管内皮细胞增殖的影响
目的 观察清活Ⅰ号中药复方水煎剂及其药物血清对高浓度葡萄糖培养的微血管内皮细胞增殖的影响.方法 采用中药血清药理学研究方法制备药物血清.原代培养SD大鼠肺微血管内皮细胞,中药复方水煎剂实验细胞分为NG-1组(葡萄糖5.56 mmol/L)、HG-1组(葡萄糖25 mmol/L)、中药-1组(葡萄糖25 mmol/L+清活Ⅰ号水煎剂)和NAC-1组[葡萄糖25 mmol/L+10 mmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC)];药物血清实验细胞分为NG-2组(葡萄糖5.56 mmol/L)、HG-2组(葡萄糖25 mmol/L)、中药-2组(葡萄糖25 mmol/L+药物血清)和NAC-2组(葡萄糖25 mmol/L+10 mmol/L NAC).培养24 h后,观察清活Ⅰ号水煎剂及其药物血清对25 mmol/L葡萄糖培养内皮细胞生长形态的影响,并采用锥虫蓝染色细胞计数观察细胞活力.结果 NG_1、HG-1、中药-1、NAC-1组的平均细胞数分别为57 000、38 333、57 333和65 000个/孔,活细胞比率分别为96.5%、58.2%、94.O%和95.8%,各组间差异均有统计学意义(P值均＜0.01).NG-2、HG-2、中药-2、NAC-2组的平均细胞数分别为38 333、10 000、37 083和55 000个/孔,活细胞比率分别为96.7%、41.7%、91.0%和94.7%,各组间差异均有统计学意义(P值均＜0.01).培养24 h后,HG-1组的内皮细胞增殖减少、活细胞减少;中药-1组的细胞生长情况和活细胞数恢复到NG-1组水平,与NAC-1组培养的细胞增殖情况相似;药物血清与中药水煎剂实验各组的细胞增殖情况基本一致.结论 清活Ⅰ号水煎剂及其药物血清均能改善高浓度葡萄糖导致的血管内皮细胞损伤,其保护作用可能与其抗氧化作用有关.
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高糖对大鼠微血管内皮细胞基因表达谱的影响
目的研究高糖对SD大鼠肺微血管内皮细胞基因表达谱的影响,进一步探索高糖导致微血管内皮细胞功能紊乱的可能分子机制.方法体外培养SD大鼠肺微血管内皮细胞,以Affymetrix公司的RG-U34A基因芯片分别检测正常浓度(5.56 mmol/L)和高浓度(20 mmol/L)D-葡萄糖培养基中培养24 h后内皮细胞的基因表达谱.结果高糖培养细胞较正常浓度糖培养细胞有961个基因表达下调,509个基因表达上调,其中变化幅度大于2倍的分别有22个(P》0.998)和11个(P《0.0025),这些基因主要与细胞物质代谢、细胞信息传递、细胞膜结构、细胞外基质合成及分解等有关.结论高糖可能通过影响微血管内皮物质代谢、信号转导、细胞膜结构和细胞外基质等的表达而导致血管内皮功能紊乱.
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细胞间粘附分子-1在局部缺血再灌流脑损伤中作用的研究
目的探讨局部脑缺血再灌流后脑微血管内皮细胞表面表达的ICAM-1参与的缺血性炎症反应.方法用免疫组织化学的方法观察大鼠左侧大脑中动脉栓堵2小时再灌流0、3、12、24、72、120小时脑微血管内皮细胞ICAM-1的表达.结果大鼠左侧大脑中动脉栓堵2小时未见ICAM-1的表达,栓堵2小时再灌流3小时病变侧脑组织微血管内皮细胞开始出现ICAM-1的表达,12～24小时达高峰,并持续至72小时,非缺血侧脑组织微血管未见ICAM-1的表达.结论 ICAM-1参与了缺血性脑损伤早期的病理过程.提示在缺血早期阻断ICAM-1的表达可能有助于减轻缺血性脑损害的程度.
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碱性成纤维细胞生长因子对脑微血管内皮细胞血管新生基因谱和环加氧酶-2表达的影响
本文研究了碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growthfactor,bFGF)对小鼠脑微血管内皮细胞(microvascular endothelial cell,MVEC)株bEnd.3中血管新生相关基因表达谱的改变,并重点从mRNA、蛋白质和细胞水平检测bFGF对血管新生旁观分子环加氧酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表达的影响.用特异性小鼠血管新生基因芯片高通量检测bEnd.3细胞基因谱表达的改变,分析促血管新生基因及抑制血管新生的基因表达谱的变化;用RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学等方法分别从mRNA、蛋白质和细胞水平检测COX-2表达变化及细胞内的定位.结果发现用10 ng/ml的bFGF刺激bEnd.3细胞2 h后多种促血管新生基因表达明显上调,如Adamts1、MMP-9、Ang-1、PDGF B、G-CSF、FGF16、IGF-1等分别上调3、8、120、5.2、4.5、1.7、2.7倍.与此同时,多种抑制血管新生的基因表达相应下调,如TSP-3、TIMP-2、TGFβ1等表达分别下调3.4、1.5和3.5倍.RT-PCR和Western blot的结果证实,bFGF可以上调COX-2 mRNA的表达和蛋白质的合成.免疫组化的结果表明,COX-2主要分布在胞浆.以上结果提示:bFGF具有上调促血管新生基因表达,下调抑制血管新生基因表达的作用,两者协同作用,促进血管新生.同时bFGF还可以明显促进血管新生旁观分子COX-2 mRNA的表达和蛋白质的合成.本文讨论了bFGF引起MVEC内COX-2表达上调的意义.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 微血管内皮细胞 血管新生 环加氧酶 -
脂多糖对人肠道微血管内皮细胞水通道蛋白-1表达及其功能的影响
目的:通过观察脂多糖(LPS)对人肠黏膜微血管内皮细胞水通道蛋白-1(AQP1)表达及mRNA水平的影响,探讨水通道蛋白在脓毒症病人肠微血管内皮细胞通透性改变中的意义. 方法:在体外培养的人肠黏膜微血管内皮细胞(HIMEC),根据LPS的浓度分为四组:即低浓度组(LPS 0.1 mg/L)、中浓度组(LPS 1 mg/L)、高浓度组(LPS 10 mg/L)和对照组(只加培养液),培养6、12和24h后,应用细胞免疫荧光RT-PCR法测定AQP1表达及其mRNA的水平. 结果:与对照组相比,LPS作用于肠微血管内皮细胞后,AQP1蛋白及其mRNA的表达均下降(P＜0.05),并且与LPS的浓度和作用时间呈相关性趋势. 结论:LPS刺激HIMEC后,AQP1出现蛋白表达量下降及其mRNA水平降低.AQP1可能与急性肠损伤后肠黏膜微血管内皮细胞的通透性增加有关.
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热休克蛋白A12B对缺血/再灌注损伤心肌微血管内皮完整性的保护作用
目的 探讨热休克蛋白A12B(heat shock protein A12B,HSPA12B)对心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤后微血管无复流现象、血管通透性及其微血管内皮结构完整性的影响.方法 实验选用同窝、8～10周龄雄性HSPA12B转基因鼠(HSPA12B Transgenic,Tg)和野生型鼠(wild type,WT).所有小鼠均接受手术,即结扎冠状动脉左前降支诱导心肌缺血(45 min),松开结扎为I/R开始.I/R 30 min后,采用番茄血凝素免疫荧光标记检测心肌微血管血流灌注情况,伊文斯兰染料检测心肌微血管渗透性.I/R4h后取小鼠心脏组织,电子显微镜观察心肌微血管内皮细胞超微结构变化.结果 I/R损伤后,与WT鼠相比,Tg鼠心肌无复流面积显著减少,血管通透性明显降低,微血管内皮细胞损伤减少且细胞间连接更加完整.结论 高表达HSPA12B显著减轻心肌I/R诱导的心肌微血管内皮细胞结构和功能损伤,从而保护心肌I/R损害,提示HSPA12B可能为治疗心肌I/R损伤的新靶点.
关键词： 热休克蛋白A12B 心肌缺血/再灌注损伤 微血管内皮细胞 -
视网膜微血管内皮细胞离子通道的特性研究
目的探讨视网膜微血管内皮细胞离子通道特性.方法膜片钳技术的全细胞记录方式.结果原代培养牛视网膜微血管内皮细胞的静息膜电位为(-34.711±2.196)mV(n＝46),几乎每次记录都发现相似的跨膜外向电流,该电流具有电压依赖性及不失活特性,能被已知的Ca2+激活K+通道特异性阻抑剂不同程度阻断.结论在视网膜微血管内皮细胞上存在Ca2+激活K+通道.
关键词： 膜片钳技术 微血管内皮细胞 Ca2+激活K+通道 -
灵芝对体外培养的微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响
目的研究不同剂量灵芝对体外培养的大鼠肺微血管内皮细胞的增殖与凋亡的影响.方法在体外培养肺微血管内皮细胞中做细胞增殖曲线,用流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡的变化.结果培养中加入灵芝(2.75mg/ml)后第4d开始细胞增殖,第7d达高峰(与阴性对照比).流式细胞仪分析,各剂量组G2-M期细胞明显增多(与阴性对照比),但细胞凋亡百分率无显著变化.结论灵芝能促进体外培养的肺微血管内皮细胞增殖作用,此作用对保护内皮损伤、加速内皮修复有重要作用.
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原位末端标记(TUNEL)法、流式细胞仪PI法和PI、Annexin V双标记法检测细胞凋亡的比较
近年来,细胞凋亡的研究引起了人们广泛的重视.人们发现有些心血管系统的疾病与细胞凋亡有关.在微循环障碍时,微血管内皮细胞的凋亡与微血管病、血栓性疾病的关系也引起了重视[1].
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骨髓微环境中微血管内皮细胞作用的研究进展
骨生长和骨重建依赖于骨内微环境中成骨细胞、破骨细胞以及其他细胞之间的相互作用[1].正常情况下,成人骨骼系统具有精细的调节功能,使骨形成和骨吸收过程处于平衡,但在老化或各种病理状态下,这种平衡状态可能就会打破[2].现已认识到起源于器官组织微循环系统的血管内皮细胞在形态和功能上是不同于起源于作为通道血管的血管内皮细胞.不同器官和组织起源的微血管内皮细胞在形态、基因、表型和功能方面都有差别,这些差别与细胞所起源的器官和组织的功能特性密切相关[3].近年来研究表明骨内微环境中存在一个复杂的由多种细胞组成的调控网络,而骨髓微血管内皮细胞可能是这个网络中的重要一员.现就骨髓微血管内皮细胞在骨微环境中的作用综述.
