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HBV Pre S1蛋白在酵母细胞中的转录激活功能
目的探索应用双杂交体系统克隆与乙型肝炎病毒(HBV)Pre S1蛋白结合的肝细胞受体的可行性.方法构建编码HBV Pre S1全序列或部分序列与酵母蛋白GAL 4 DNA结合区域融合蛋白的酵母表达质粒,应用这些质粒转化酵母报道菌株SFY526,检测β-半乳糖苷酶活性作为酵母中转录激活的指标.构建编码Pre S1全序列与GAL4 DNA结合区域融合蛋白的哺乳动物细胞表达质粒,与CAT报道质粒共转染肝癌细胞系Huh-7,使用薄层层析法检测细胞提取物的氯霉素乙酰转移酶活性.结果全序列Pre S1蛋白与GAL4 DNA结合区域的融合蛋白在酵母细胞中呈现转录激活功能,其转录激活序列被定位于Pre S1第21～47氨基酸之间.全序列Pre S1蛋白与GAL 4 DNA结合区域的融合蛋白在哺乳动物细胞中未呈现转录激活功能.结论 HBV Pre S1蛋白在酵母细胞中的转录激活功能,限制了研究人员应用酵母双杂交体系统克隆与Pre S1结合的HBV受体.然而,Pre S1蛋白在哺乳动物细胞未呈现转录激活功能.哺乳动物细胞双杂交体系统可能是克隆与Pre S1蛋白作用的肝细胞受体的可行途径.
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酵母双杂交技术筛选乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP结合蛋白的研究
目的筛选与乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶-N末端蛋白(TP)相互结合的肝细胞蛋白,进一步探讨TP的生物学功能.方法用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP片段,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH 109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖苷酶(X-α-gel)上进行双重筛选阳性菌落,DNA序列测定并进行生物信息学分析.结果成功获得了47个与TP特异性结合的阳性克隆,包括人类固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)、RNA聚合酶Ⅱ亚单位(hsRPB7)、血浆铜蓝蛋白(CP)等21种已知功能蛋白质基因和19个假设蛋白基因.结论HBV DNA聚合酶-TP可以与某些已知和未知功能蛋白相互结合,提示其具有较广泛的生物学功能.
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酵母双杂交技术筛选研究乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP结合蛋白
目的筛选与乙型肝炎病毒DNA聚合酶-N末端蛋白(TP)相互结合的肝细胞蛋白,进一步探讨TP的生物学功能.方法酵母双杂交相关实验材料购自美国Clontech公司,其中pACT2为人肝配合表达的cDNA文库(HumanLiver MATCHMAKER cDNA Library),产品号为HLA024AH.pGBKT7-53和pGADT7-T中的p53和大T抗原在酵母双杂交试验中相互作用,为阳性对照,pGBKT7-Lam中的Lamin C既不与其他蛋白形成复合物又不与大多数蛋白发生反应,为阴性对照.含有AF384372 HBV DNA P全基因组cDNA的质粒G318A7由解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心合成并保存.TP基因的上下游引物序列分别为:5'-GAA TTC ATG ATG CCC CTA TCT TAT CAA-3′,5′-GGA TCCTTA CTC TTG TTC CCA AGA ATA-3′,下划线部分为引物两端内切酶EcoRI和BamHI的酶切位点.引物合成及DNA测序由上海博亚公司完成.用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP片段,连接人酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,用醋酸锂法转入酵母细胞AH109并在其内表达,挑取在SD/-Trp培养基上的转化子-即pGBKT7-TP(AH109)(计数大于1×109个细胞/ml),与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187配合,生长6～18 d后把长出的＞2 mm的酵母集落,在铺有X-α-gal的QDO培养基上检查α-gal活性,蓝色菌落为真阳性集落.挑取阳性集落提取酵母质粒,以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠埃希菌,于含有氨苄西林的SOB平板培养,所获得的菌落酶切鉴定后测序.提交GenBank分析.结果成功得到47个与TP特异性结合的阳性克隆,28个克隆与已知基因的部分序列高度同源(96%～100%),含21种目的基因,其余19个克隆基因为假设蛋白(hypothetical pro-tein).筛选出的目的基因包括有:固醇调节元件结合蛋白1;UDP糖基转移酶1家族多肽A9;CD14抗原;β糖蛋白血液结合素;Ⅰ类乙醇脱氢酶γ多肽;WW域结合蛋白2;醛脱氢酶1;延伸因子2;S蛋白基因;补体成分8,α多肽(C8A);唾液酸糖蛋白受体2,转录变异体3;肉毒碱酰基转移酶,转录变异体3;血浆铜蓝蛋白(CP);β激活素E亚基;Z蛋白依赖性蛋白酶抑制剂前体;前列腺特异性膜抗原基因;11号染色体,克隆RP11-107P7;RNA聚合酶Ⅱ亚单位hsRPB7 mRNA;跨膜蛋白4超家族成员2;跨膜蛋白14 A;铁蛋白L链.19个假设蛋白的同源性在97%～100%.结论TP蛋白可以与肝细胞内某些已知和未知功能蛋白相互结合,提示其具有较广泛的生物学功能.
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肠道上皮特异性基因CDX2
同源异型框基因及相关蛋白是指在生物体中一个具有相对保守序列的基因及蛋白家族,广泛存在于从酵母到乳动物的所有真核生物,对生物的发育和细胞分化具有重要的调节作用.本文主要从各个方面对肠道hui特异性表达的同源异型框转录因子-CDX2(caudal-related homeodomain transcripdon 2)做一简单概述.
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控制血糖主食选择是关键
摊玉米面饼原料:玉米面250克、面粉50克、豆浆200克、酵母10克.操作方法:1.将玉米面、面粉、酵母放入盆中,加入豆浆和少许温水,和成稀糊状,用保鲜膜封住盆口,待面糊发酵半小时.2.电饼铛上下火加热至190度,在表面薄薄的擦上一层油,用小勺将面糊搅拌均匀,一勺子面糊摊一个饼子生坯,逐个倒入电饼铛,摊满饼铛后盖上盖,2分钟后开盖,翻个面再烙另一面,一分钟后出锅即可.
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糖友牢记5点补好维生素
糖友补充维生素等营养,需要视自身病情而定.英国“糖尿病网”新载文称,糖尿病患者补前好征求医生建议.12型糖友补点B族维生素.2型糖尿病的主要代谢特征是胰岛素抵抗,胰岛素抵抗过程中会消耗大量的B族维生素.所以,糖友必须适当补充,如多吃猪肝、鸡肉、羊肉、蛋黄、牛奶、酵母、大豆、扁豆、杏仁、腰果、核桃、菜花和蘑菇等.
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糖友补维生素注意5点
糖友补充维生素等营养,需要视自身病情而定,糖尿病患者补充维生素之前好征求医生建议.1.2型糖友补点B族维生素.2型糖尿病的主要代谢特征是胰岛素抵抗,胰岛素抵抗过程中会消耗大量的B族维生素.所以,糖友必须适当补充,如多吃猪肝、鸡肉、羊肉、蛋黄、牛奶、酵母、大豆、扁豆、杏仁、腰果、核桃、菜花和蘑菇等.
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糖尿病患者进补维生素4原则
糖尿病患者的病情比较复杂,因此需要根据病情来补充不同的维生素.1.单纯糖尿病病人——补充B族维生素2型糖尿病的主要代谢特征是胰岛素抵抗.因为胰岛素抵抗,机体错误地认为"血糖不足",就要动员脂肪和蛋白质分解,来生成血糖.在这个过程中会消耗大量的B族维生素素.因此,糖尿病病人应适当补充B族维生素,也可通过食补,如酵母、动物肝脏、大豆、蛋黄等.
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Plk1基因及其与胰腺癌的关系
Plk1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,1994年由Golsteyn等[1]首先克隆发现,与果蝇的Polo和酵母的Cdc5具有较高同源性.
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SIRT1:衰老、代谢领域分子学研究新热点
SIRT1是衰老和代谢领域的分子学研究热点.SIRT1起初被认为是长寿基因,其表达能够延长酵母的存活期.但近期发表于 《Sicence》的一篇研究却对SIRT1的这一作用提出质疑[1].其对酵母的长寿作用似乎并不能在一些实验室中获得证实.无论如何,起初的研究的确促进了对于SIRT1代谢作用的探讨,该基因也被发现能够调节脂肪酸代谢.有研究显示,SIRT1的活性是经由蛋白质磷酸化、泛素化和蛋白酶体一介导的降解作用来调节的[2].
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人醛糖还原酶基因在酿酒酵母中的诱导表达及活性分析
目的 建立人醛糖还原酶(AR)及其与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达的酿酒酵母细胞表达株,检测细胞中目的基因的表达及蛋白活性.方法 将含目的基因AR及融合基因AR::GFP的重组质粒pYEX-BX转化酵母细胞INVScl,得到宿主菌株XAR,XAG及对照菌株YEX.观察酵母细胞生长曲线及GFP荧光信号；Northern blot检测细胞中AR mRNA转录；Western blot检测AR蛋白表达；荧光法测定AR活性.结果 三菌株生长速率无明显差异；XAG菌株相对荧光强度与生长时间成线性关系;XAR,XAG菌株分别有持续、稳定的目的基因mRNA转录及目的蛋白表达,并具有AR活性.结论 成功构建了AR基因的酵母表达株,为进一步将此细胞株应用于研究AR的致病机制及AR抑制剂的初步筛选打下基础.
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乙型肝炎病毒前S1基因酵母表达载体的构建及表达
为探讨乙型肝炎病毒(HBV)前S1蛋白的功能,在真核生物酵母细胞中表达HBV前S1基因.以HBV ayw亚型全长质粒pCP10为模板,多聚酶链反应(PCR)扩增HBV前S1基因,克隆到pGEM-T 载体中,双酶切后回收与酵母表达质粒pGBKT7连接.将重组载体转化酵母细胞AH109,提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析.结果成功地构建了HBV前S1基因酵母表达载体,Western 免疫印迹显示HBV前S1在酵母细胞中表达,表达产物在胞内存在,分子量30kD左右.表明HBV前S1蛋白在酵母细胞中表达成功.
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过表达N－糖基转移酶的糖基工程酵母构建
目的：通过过表达N－糖基转移酶，构建1株糖基化修饰效率更高的糖基工程酵母。方法利用尿嘧啶（URA3）营养缺陷型筛选标记，在糖基工程酵母4－32中转入醇氧化酶1（alcohol oxidase 1，AOX1）启动子控制的利士曼原虫N－糖基转移酶星状孢子素和温度敏感性酶3（staurosporine and temperature sensitivity 3，STT3）D亚基，通过SDS－PAGE、Western印迹和肽N－糖苷酶F（peptide－N－asparigineamidase F，PNGase F）酶切等方法，分析4－32－STT3D表达的抗人表皮生长因子受体2（HER2）抗体（anti－human epidermal growth factor receptor 2）和粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte－macrophage colony－stimulating factor，GM－CSF）N－糖基化程度，并测定STT3D转入和诱导表达对酵母生长情况的影响。结果 SDS－PAGE结果显示，4－32－HL菌表达的抗HER2抗体除有一条相对分子质量约55×103的重链主带外，还有一条约50×103的未糖基化条带。4－32－HL－STT3D菌表达为均一的55×103条带，无50×103条带。 PNGase F酶切后，上述重链呈50×103的均一条带。 Western印迹证明以上所有条带均为抗体成分。以GM－CSF作为报告蛋白验证STT3D的作用，结果显示，4－32－GM－CSF菌表达的GM－CSF为22×103和20×103的两条带，而4－32－GM－CSF－STT3D表达则为均一的22×103条带。 PNGase F酶切4－32－GM－CSF和4－32－GM－CSF－STT3D菌表达的GM－CSF后，GM－CSF呈18×103的均一条带。分别测定STT3D外源基因转入和诱导表达时对酵母生长情况的影响，统计学分析显示，STT3D转入不诱导对酵母生长影响不显著，STT3D诱导表达对酵母生长影响极显著。结论过表达N－糖基转移酶的糖基工程酵母对靶标蛋白具有更高的N－糖基化修饰效率。
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A型肉毒毒素保护性抗原在酵母细胞中的表达与抗原性分析
目的:在酵母系统中实现A型肉毒毒素(BoNTa)Hc基因的可溶性分泌表达.方法:将Hc基因克隆入表达载体pPIC9K,用SacⅠ将重组质粒线性化,电转化巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris )GS115细胞,筛选G418抗性阳性整合子,进行Mut+表型株甲醇快速利用诱导.结果:经过体外高拷贝整合子的筛选和诱导表达条件的优化,毒素Hc在pH 6.5培养基 BMMY中实现稳定的分泌表达,终筛选到蛋白表达量占上清蛋白10%的分泌高表达株.免疫印迹和酶联免疫检测结果显示,重组BoNTa Hc可以识别特异抗肉毒马血清并具良好的特异结合活性,可以诱导小鼠产生特异性抗体.结论:酵母系统来源的具有良好免疫原性的重组BoNTa保护性抗原可以作为有效的候选重组疫苗分子.
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分子伴侣对酵母朊病毒［ PSI＋］增殖影响的研究进展
酵母朊病毒（ prion）的发现和研究在生物学和医学上有着极其重要的理论价值和实际应用价值。该文综述了分子伴侣对酵母prion[PSI＋]增殖影响的研究进展，重点介绍了热休克蛋白Hsp104p、Hsp70p和Hsp40p在其中发挥的重要作用。
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一种快速鉴定重组酵母克隆的方法
甲基营养型毕赤酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是目前较为有效的外源基因表达系统,可实现目的蛋白的高效分泌表达,且可对目的蛋白进行糖基化加工等[1].
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去乙酰化酶1介导衰老相关疾病的发病机制及其与运动的关系
体育运动能延缓衰老,包括预防并延缓多种衰老相关性疾病,如2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)、阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)、骨骼肌肌减少症(Sarcopenia)的发生.体育运动抗衰老效应及其相关机制是当前研究的一个热点话题.Noakes等[1]将其归因于脑源神经营养因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF).这里讨论更为基本的依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶(Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD+)的去乙酰化酶(Sirtuins,SIRTs)家族.去乙酰化酶1(Sirtuin1,SIRT1)是SIRTs家族中与酵母沉默调控基因2(Silent Information Regulator 2,Sir2)同源性高的,是当前研究的热点.研究发现衰老会引起SIRT1水平下降[2].
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氧嗪酸钾联合酵母对SD大鼠尿酸生成和排泄及肾功能的影响
目的 观察氧嗪酸钾联合酵母对大鼠血尿酸(UA)水平及UA生成、排泄和肾功能的影响,探讨氧嗪酸钾联合酵母诱导大鼠高尿酸血症的作用特点.方法 SD大鼠分别给予酵母膏21 g·kg-1+氧嗪酸钾100,200和300 mg·kg-1,每日1次,连续35 d.分别于第14,28和35天检测血清UA、肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)水平及腺苷脱氨酶(ADA)、黄嘌呤氧化酶(XOD)和鸟嘌呤脱氨酶(GuDa)活性,第28天检测尿液UA、CRE、BUN和尿蛋白水平与尿比重、尿量并计算UA排泄量和UA清除率,第35天处死大鼠取右肾称重并计算肾指数.结果 与正常组比较,第14,28和35天3个给药组血UA水平均显著升高(P＜0.01);第35天3个给药组血CRE水平均显著升高(P＜0.05,P＜0.01);第14天酵母膏21 g·kg-1+氧嗪酸钾100和300 mg·kg-1组ADA水平显著降低(P＜0.05),第14和28天酵母膏21 g·kg-1+氧嗪酸钾200 mg·kg-1组ADA活性水平显著降低(P＜0.01);第1 4和28天酵母膏21 9·kg-1+氧嗪酸钾300 mg· kg-1组XOD活性显著升高(P＜0.05,P＜0.01);第28天3个给药组UA排泄量和UA清除率显著降低(P＜0.05,P＜0.01);第35天3个给药组肾指数显著升高(P＜0.01).结论 酵母膏联合氧嗪酸钾使大鼠血清UA水平升高,可能与XOD和ADA活性变化及肾UA排泄障碍有关,UA排泄障碍的发生可能与肾功能的变化有关.
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提高酵母S-腺苷甲硫氨酸表达量的研究
目的 介绍S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)在Saccharomyces cerevisiae中的合成代谢机制和利用代谢工程改变酵母细胞的相关代谢途径,提高细胞SAM表达量,以及通过发酵工艺调控,提高SAM产率的有关研究进展.方法 对近年来的相关研究报道与成果进行综合分析.结果与结论 代谢工程与微生物发酵工艺调控相结合的方法,是提高酵母SAM表达水平的切实有效的途径.
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人类DNA修复蛋白hR24Lp具有转录激活作用
hR24L是本实验室首次用遗传互补法克隆出的人类DNA修复基因,它与酵母RAD24L(又称RAD24)基因同源.人类hR24L基因能校正酵母RAD24L突变株的紫外线敏感表型和X线敏感表型,参与DNA切除修复和重组修复.
