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PrPC转化成PrPSc的影响因素研究进展
朊病毒蛋白有两种形式,即PrPc和PrSc.PrPc是正常的细胞蛋白;而PrPSc是PrPc的异构体,具有致病性.大量的证据表明朊病毒是由PrPc错误折叠从而转变成PrPSc的,朊病毒病的发生与发展与PrPc转变成PrPSc密切相关,朊病毒病属于蛋白质构象病.本文将着重叙述PrPc转化成PrPSc的各种影响因素.
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朊病毒致病机理的研究进展
朊病毒可以引起人和动物的一系列致死性的神经退行性疾病,对人和动物的危害很大.本文就朊病毒的致病机理以及朊病毒病治疗的前景做一综述,并简介朊病毒的感染和增殖.
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099 疯牛病研究进展
疯牛病是由朊病毒PrPsc引起的一种慢性、渐进性、致死性传染病,以神经症状为主.它不仅可以在动物间传播,还很可能传染给人,引起人的新型变异型克雅病,给畜牧业和人类健康带来严重危害.2000年10月,新一轮疯牛病危机在欧洲的暴发更加剧了全世界对疯牛病的恐慌.本文从病原学、流行病学、临床诊断学、预防医学等方面,较为全面而详细地综述了疯牛病的病原特征、传染源、传播途径以及防治措施等内容,为进一步建立和完善我国疯牛病的监测防治体系提供科学依据.
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1例克雅病院内感染防控措施
目的 建立一例克雅病医院感染防控措施.方法 通过严格的消毒隔离方法,预防朊病毒医源性传播.结果 本医院对一例疑似克雅病的病人经流行病学调查和实验室检查作出诊断;经过精心治疗病情得到好转.通过严格消毒隔离和管理污染物品,没有造成医源性污染扩散和传播.结论 医院接收到疑似病例必须严格检查诊断,明确诊断后积极采取科学防范措施,避免污染扩散和医源性传播.
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我国人类朊病毒病检测监测体系建立及相关基础和应用研究
目的 在我国开展克雅氏病(CJD)监测,探讨朊病毒病的发病机制.方法 采用多学科交叉技术开展以疾病监测为导向的应用研究和发病机制为导向的基础研究.结果 建立了CJD病原学诊断技术,制定了<克雅氏病诊断标准>,开展了覆盖12个省(市)自治区的CJD监测.首次较全面地了解了我国CJD病人的流行病学、临床和实验室特征;首次报道了我国多种遗传型CJD病例.建立了包括朊病毒实验动物平台、体外无细胞转化平台、PMCA平台、PrPSc抗原库等技术平台.首次发现了朊病毒可利用脾脏和肌肉组织进行复制、NADPH可促进PrPSc增殖;系统描述了PrPSc和其他神经因子在疾病潜伏期和终末期的变化;报道了PrP蛋白与多种神经蛋白发生相互作用;证明了PrP蛋白序列、二级结构、糖基化类型及胞内存在位置的改变均可诱导细胞凋亡.结论 本研究直接服务于我国朊病毒病的防控工作,为朊病毒的研究积累了重要的科学数据.
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经络是干细胞系——兼论微体、病毒是LTR基因进化的基本载体
经络系统就是由循行分布在组织中的成体干细胞及其定向干细胞构成的开放的复杂的巨系统，经穴、络穴是成体干细胞及其定向干细胞的富集点，经脉、络脉的分类对应着成体干细胞的划分归类。 1 中医经络学说揭示了成体干细胞及其定向干细胞在组织中的循行分布规律……
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细胞浆中PrP蛋白的表达及其细胞毒性作用的研究
为了探讨在胞浆中表达的PrP的理化特征以及对细胞活性的影响,我们构建了胞浆型PrP(CytoPrP)真核表达质粒,瞬时转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,通过蛋白酶敏感性实验检测CytoPrP及其蛋白酶抗性,利用MTT和Trypan Blue细胞计数检测CytoPrP的细胞毒性作用.结果显示,CytoPrP在胞浆内的存在受蛋白酶抑制剂的控制;与野生型PrP相比,CytoPrP具有相对较强的蛋白酶K(PK)抗性.MTT和细胞计数实验均显示,Cyto-PrP的存在可诱导明显的细胞毒性效应,而CytoPrP的细胞毒性作用受蛋白酶抑制剂含量的影响,呈剂量依赖关系.上述结果为研究CytoPrP在朊病毒病的发病机制中的意义提供了一定的科学数据.
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一种基于链霉素沉淀的PrPSc检测方法的建立
建立一种新的基于链霉素沉淀的PrPSc的Western blot检测方法,用终浓度为60 mmol/L的链霉素处理蛋白酶K消化的PrPSc贮存液,通过离心沉淀PrPSc,用Western blot对PrPSc的链霉素富集效果进行检测.结果显示,链霉索能够与PrPSc结合形成高分子量复合物,但不影响糖基化形式.此外,基于链霉素沉淀的Western blot,无论是在低浓度或是大容积的条件下,均可显著地提高对PrPSc检测的敏感性.基于链霉素沉淀的Western blot试验是一种敏感、特异、快速及灵活的检测方法,有潜力用于脑组织、外周组织及体液中低水平的PrPSc的检测.
关键词： 朊病毒 链霉素沉淀 Western blot 分子诊断技术 -
感染羊瘙痒因子263K株或139A株仓鼠脑组织中tau蛋白和磷酸化tau蛋白变化的研究
为探讨朊病毒病的神经病理特征,应用Western blot方法检测了感染羊瘙痒因子263K株或139A株的仓鼠脑组织中总tau蛋白和Ser396和Ser404位点发生磷酸化tau蛋白表达水平的变化;并应用Real Time PCR方法检测了tau mRNAs转录活性的改变.结果表明总tau蛋向含量升高而Ser396和Ser404位点发生磷酸化的tau蛋白含量降低,该现象与羊瘙痒因子毒株类型和临床潜伏期无关;感染羊瘙痒因子的仓鼠脑组织中Tau2和Tau4这两个异构体的转录水平升高.这些结果表明tau蛋白在Ser396和Ser404位点的去磷酸化可能与朊病毒病发病相关.
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一些化学和物理因素对羊瘙痒因子263K蛋白酶抗性的影响
朊病毒(prion)具有超强的理化因素抵抗能力,可抵抗常规物理和化学因子对其感染性的灭活.为了研究不同理化因素对PrPSc蛋白酶抗性的影响,采用不同浓度的NaOH、NaOCl、SDS、温度变化以及3%SDS与温度变化联合处理羊瘙痒因子263K,再经蛋白酶K(Proteinase K,PK)消化,通过Western blot检测观测PrPSc的PK抗性.结果发现,上述几种理化因素对羊瘙痒因子263K的PK抗性有不同程度的破坏作用.NaOH浓度在0.05mol/L以上,NaOCl游离氯含量在0.1%以上,温度在121℃以上都能使PrPSc的PK抗性消失;而1%～5%SDS不能使PrPSc的PK抗性完全消失,3%SDS与温度的联合作用可有效地破坏PK抗性,同时使所需温度降低.还发现,在较低浓度的化学因子或温度的条件下即可出现PK抗性的破坏,而在较高浓度或温度处理时才出现蛋白本身的消失.这些结果提示,与PrPSc感染性的结果相似,PK抗性可受相似浓度或强度的理化因素影响,具有明显的浓度或强度相关性,对判定消除PrPSc的感染性有一定的指导意义.
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疯牛病与新型克-雅病研究进展
朊病毒是一种不含核酸的感染性蛋白颗粒,能导致哺乳动物中枢神经系统组织的病变,其繁殖是通过构象变构由正常型(PrPc)转变为致病型(PrPSc)而完成的.这两种结构异型体来源于同一基因,具有相同的氨基酸序列,但其二级和三级结构不同.作者就疯牛病和新型克-雅病的病原、结构特征、诊断与防治作此综述.
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朊病毒感染与内源性嘌呤受体P2X7相互关系的研究
目的 明确朊病毒感染对P2X7受体的影响,并评价P2X7受体活化对朊病毒复制的作用.方法 Western Blot检测朊病毒毒株263K感染的仓鼠、ME7和139A感染的C57 BL/6小鼠和稳定感染羊瘙痒因子Chandler株的小鼠神经细胞系SMB-S15中P2X7受体的蛋白表达,并检测P2X7激活剂ATP对SMB-S15细胞中朊病毒PrPSc含量的影响.结果 朊病毒感染的动物及细胞模型中,P2X7受体表达降低(P＜0.05),ATP孵育4d可降低SMB-S15细胞中PrPSc的含量.结论 P2X7信号通路活化对朊病毒感染细胞具有一定的保护作用.嘌呤信号通路有望为抗朊病毒治疗提供新的靶点.
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两种分泌抗PrP单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其初步鉴定
目的制备具有广谱种属反应性的PrP单克隆抗体(McAb),用于可传播性海绵样脑病(TSE)的诊断及致病机制研究.方法分别将对应于牛PrP29～48 (BoP1)、PrP89～108 (BoP2)的两种多肽与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫BALB/c小鼠,经细胞融合后获得分泌针对上述两种多肽的杂交瘤细胞株,用Western-blot方法检测这些细胞株分泌的McAb与牛(Bo)、人(Hu)和仓鼠(Ha)PrP蛋白的反应性.结果通过细胞融合和2～3轮克隆化,用ELISA筛选出分泌抗BoP1和BoP2抗体的杂交瘤细胞株D11和D8.Western blot显示,获得的McAb均能分别与重组BoPrP(25～242)、重组HuPrP(23～231)和HaPrP(23～231)反应.结论获得了可与牛、人和仓鼠PrP反应的两种McAb,可用于哺乳类PrP检测及TSE致病机制研究.
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酵母朊蛋白Sup35NM体外淀粉样纤维的形成动态研究
目的研究酵母朊蛋白Sup35在近似于生理环境的体外条件下淀粉样纤维形成的动态过程,为阐明淀粉样纤维的形成机制提供材料和线索.方法在E.coli中表达Sup35蛋白的NM段,并用Ni2+螯合层析对重组蛋白在变性条件下进行纯化,在不同的时间点用透射电子显微镜观察、圆二色谱检测以及蛋白酶K消化试验,同时利用硫黄素(thioflavinT,ThT)结合试验对淀粉样纤维形成的动态过程进行检测.结果在变性条件下成功纯化出Sup35NM重组蛋白.利用透射电子显微镜观察到了Sup35NM蛋白在PBS(pH 7.4)缓冲液中发生聚集时的形态变化,圆二色谱检测显示该过程伴随蛋白结构由α-螺旋到β-折叠的转变.纤维具有较强的抗蛋白酶K消化的特性.ThT结合试验提示淀粉样纤维的形成在经过了一个快速的上升阶段后达到平台期,纤维形成的速率会随着蛋白浓度的提高而加快.结论酵母朊蛋白Sup35NM在接近生理环境的体外条件下极易发生聚集,聚集物具有淀粉样纤维性质,Sup35NM淀粉样纤维形成的动态过程为淀粉样变成核聚集模型的研究提供了依据.
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定位表达于溶酶体、泛素的PrP载体的构建及鉴定
目的 构建定位于溶酶体、泛素的PrP表达载体,并进行蛋白表达特点及定位的鉴定.方法 将泛素基因、溶酶体膜定位信号序列基因和PrP基因连接,克隆至pcDNA3.1载体中,构建表达载体pcDNA3.1-UPrP、pcDNA3.1-PrPL;瞬时转染真核表达细胞,经Western Blot和间接免疫荧光技术检测PrP表达特点.结果 构建的各种PrP定位表达载体均可定位表达具有三种类型的糖基化分子的PrP,以双糖基化分子类型多.带有泛素、溶酶体信号的质粒pcDNA3.1-UPrP、pcDNA301-PrPL的PrP表达随着时间的延长蛋白表达量下降,提示泛素、溶酶体信号能加速表达PrP在细胞内的降解.结论 成功构建了溶酶体、泛素定位表达的PRNP核酸疫苗载体pcDNA3.1-UPrP、pcDNA3.1-PrPL,为PRNP核酸疫苗的研究奠定了一定的基础.
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朊蛋白N端和C端多肽特异性抗体的制备及ELISA检测技术的研究
目的 制备朊蛋白N端和C端多肽特异性抗体,并对ELISA方法在朊病毒病检测中的应用进行研究.方法 构建人朊蛋白N端和C端多肽原核表达重组质粒,分别表达纯化融合蛋白.以此为抗原制备朊蛋白N端和C端多肽特异性抗体.ELISA和Western Blot检测所制备抗体与重组和天然的PrP蛋白的免疫反应性.初步建立间接ELISA检测技术.结果 所制备的N端和C端抗体可特异性识别重组全长PrP蛋白和相应的PrP片段,无明显交叉反应.C端抗体还可有效地识别感染羊瘙痒因子263K的仓鼠脑组织中经PK消化后的PrPSc,其Western Blot反应带型与PrP单抗3F4相似.5000 r/min离心处理脑组织悬液可有效保留上清中PrPSc成分而不影响ELISA检测.蛋白酶K虽经灭活处理,但可明显抑制重组和天然PrP在液相中与相应抗体的结合.间接ELISA方法可根据反应A值区分正常或感染动物样本.结论 所制备的朊蛋白N端和C端抗体具有良好的特异性,C端抗体可用于实验性朊病毒病的检测.建立的间接ELISA方法可试用于朊病毒病的初步筛查.
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一种朊蛋白错误折叠循环扩增方法的建立
目的 建立一种类似于PCR的蛋白质扩增方法-蛋白错误折叠循环扩增技术(PMCA),用于朊病毒病脑组织中PrPSc的检测.方法 将不同浓度的羊瘙痒因子263K毒株原液与正常仓鼠脑组织匀浆混合,经反复孵育/超声,共10～15个循环.Western Blot检测扩增产物中蛋白酶K抗性PrPSc信号.结果在本研究试验体系下,263K毒株可以利用仓鼠脑组织为基质在体外迅速复制.所建立的PrPSc-PMCA技术可检测到10-5稀释的毒株原液中的PrPSc.与常规的脑组织免疫印记方法相比,敏感度提高了105～106倍.研究还显示PrPSc还可利用小脑和脑干为基质进行体外扩增复制.结论 成功建立了PrPSc-PMCA技术,为朊病毒病的早期诊断和朊病毒生物学特性的研究提供了一种新的手段.
关键词： 朊病毒 蛋白错误折叠循环扩增技术 -
PrP及其缺失突变体与GFAP体外相互作用的初步研究
目的 研究PrP蛋白与GFAP蛋白是否发生分子间相互作用以及PrP蛋白多肽链中与GFAP蛋白相互作用的区域.方法 制备仓鼠脑组织匀浆上清,通过原核表达系统以及体外翻译系统表达了全长的小鼠GFAP蛋白、人PrP蛋白以及各种缺失突变体,利用Pull-down及免疫共沉淀实验检测PrP与GFAP的分子间相互作用.结果 不仅重组的GFAP与PrP发生分子间的相互作用,而且脑组织中的GFAP与PrPC及PrPSc也发生相互作用.PrP与GFAP蛋白相互作用的区域位于PrP的C端第91至231位氨基酸.结论 PrP及其缺失突变体与GFAP在体外能够发生分子间的相互作用,提示GFAP可能参与朊蛋白的正常生理功能或者朊病毒病的病理过程.
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朊蛋白突变体D178N在RT-QuIC实验中的转化研究
目的 利用RT-QuIC研究带有D178N突变的朊蛋白的自我转化能力.方法 以带有人PRNP基因的质粒为模板,通过定点突变,构建了带有D178N突变的人PRNP基因,利用原核表达系统表达并纯化了带有N端及N端缺失的D178N朊蛋白.分别将此蛋白作为底物,利用RT-QuIC体外纤维形成实时监测系统,对各种突变蛋白体外纤维形成进行了观察和比较,并对形成纤维蛋白的蛋白酶抗性进行了初步分析和比较.结果 正确构建了D178N突变的PRNP基因;在RT-QuIC的反应条件下,缺失N端的带有D178N突变的人朊蛋白,即使在不存在prpSc种子的情况下,在体外也能够发生自我转化,且形成的纤维具有蛋白酶抗性;而带有N端的D178N突变的朊蛋白,在RT-QuIC的反应条件下不发生自我转化.结论 朊蛋白N端对D178N突变的朊蛋白自发纤维形成具有一定影响,这为探索和研究遗传型克雅病的致病机制提供了重要线索.
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ATP结合盒转运蛋白A1在仓鼠和SMB-S15细胞朊病毒感染模型中表达及活性的研究
目的 评价胆固醇转运子ABCA1在朊病毒病中所发挥的作用.方法 运用WesternBlot检测朊病毒毒株263K感染的仓鼠脑组织和稳定感染羊瘙痒因子Chandler株的小鼠神经细胞系SMB-S15中ABCA1表达的变化,并检测ABCA1激活剂8-Br-cAMP对SMB-S15细胞中朊病毒prpSc含量的影响.结果 与正常对照相比,朊病毒感染的动物及细胞模型中ABCA1蛋白表达显著升高(P＜0.05),并且在细胞模型中ABCA1活化显著增加prpSc的含量.结论 以上结果提示ABCA1与朊病毒感染的相互关系.该项研究为探索朊病毒复制的分子机制提供了新的思路,同时为以控制胆固醇内稳态为靶点的抗朊病毒治疗提供了理论依据.
