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黄芪对体外B组柯萨奇病毒持续感染抑制作用的研究
目的:探讨黄芪水提液对持续感染细胞模型中CVB3、CVB5的作用.方法:不同浓度黄芪水提液作用于持续感染CVB3、CVB5的ECV304细胞模型,原位ELISA,细胞保护试验,病毒滴度测定了解持续感染细胞模型中CVB3、CVB5增殖情况的改变.结果:经黄芪作用后,CVB3-ECV304和CVB5-ECV304持续感染细胞模型病毒抗原表达减少,细胞模型培养上清液中病毒含量减少,致Vero细胞病变程度减轻.结论:黄芪可体外抑制持续感染细胞模型中CVB3、CVB5的增殖.
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厌氧培养箱法建立大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型
目的 探讨建立大鼠心肌细胞H9c2缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤模型的一种新方法.方法 实验使用大鼠心肌细胞H9c2,随机分为对照组和实验组,对照组常规培养不做处理,实验组分为缺氧2、4、8、12 h及缺氧后复氧2h组.缺氧时换不含血清的低糖DMEM培养基,再置入85％ N2、10％H2、5％ CO2缺氧环境.缺氧后,加入新鲜DMEM培养基,置入二氧化碳培养箱中继续培养2h.苔盼蓝染色检测细胞存活率,Annexin V/PI染色行流式细胞术检测细胞凋亡率,分光光度法检测培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)含量.结果 大鼠心肌细胞经过H/R处理后,与对照组比,细胞存活率显著下降,LDH含量升高,细胞凋亡率显著增加,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 采用厌氧培养箱法建立大鼠心肌细胞H/R损伤模型简单易行,重复性好.
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纳米银对人胚干细胞来源的成纤维细胞的细胞毒性评价研究
目的 探索人胚干细胞来源的成纤维细胞(EBF)作为纳米银颗粒细胞毒性评价模型的可行性,旨在为纳米材料生物安全性评价提供新的细胞模型.方法 将纳米银与EBF细胞共孵育,采用相差显微镜、CCK-8法、流式细胞术和透射电子显微镜分别对细胞形态、细胞增殖、细胞周期及细胞摄取进行研究.结果 纳米银颗粒对EBF活性的影响是浓度和时间依赖性的,纳米银可以进入细胞内并引起细胞周期阻滞.结论 EBF可以作为一种新的纳米银颗粒生物安全性评价模型,由于其来源的特殊性,可进一步模拟人体正常细胞的反应.
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大鼠kir2.1通道重组质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达
内向整流钾电流(IK1)是心肌主要的背景外向电流,参与静息电位的维持和心肌动作电位3 期终末的复极,进而调控心肌的兴奋性和传导性[1,2].已知心肌细胞IK1通道主要由Kir2 亚家族(Kir2.x) 中的Kir2.1、Kir2.2 和Kir2.3 构成,它们的编码基因分别是KCNJ2、KCNJ12 和KCNJ4.其中,Kir2.1是重要的亚型[3], 也是组成人类心肌细胞IK1电流的主要亚单位[4],大量研究表明IKir2.1减弱或增强均可导致严重的心律失常[1,2].基于此,国内外众多学者在抗心律失常药物筛选过程中将目光投向了Kir2.1 通道,Kir2.1 通道电流克隆细胞模型成为必备的研究工具.本研究利用分子克隆技术, 构建pEGFP-N1-Kir2.1 真核表达质粒, 并对其在人胚胎肾细胞(HEK293)中的表达进行检测.
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肝细胞生长因子对高糖环境下肾小管上皮细胞增殖及转化生长因子β1表达的影响
糖尿病肾病(DN)是糖尿病的常见微血管慢性并发症之一,是导致慢性肾功能不全的重要原因.转化生长因子β1(TGF-β1)被认为是DN中促小管间质病变的重要的因子之一,TGF-β1可促进肾小管细胞向成纤维细胞的转分化.肝细胞生长因子(HGF)是一种多效性生长因子,它介导上皮-间质和内皮-间质之间相互分化,不仅与器官发育形成和再生修复有关,而且也可作为负性调节因子,在肝硬化、肺纤维化中起重要的抗纤维化作用;HGF还是一种促细胞修复因子,在DN肾修复过程中可能起着一定的作用.本研究通过体外细胞模型,探讨HGF对高糖环境下肾小管上皮细胞的作用.
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西妥昔单抗对不同级别人脑胶质瘤细胞体外药敏实验的研究
胶质瘤的治疗仍以手术切除为主,辅以放疗、化疗等综合治疗,但总体疗效仍不满意.目前,西妥昔单抗(cetuximab)应用于脑胶质瘤的报道较少.本实验通过胶质瘤原代细胞培养建立胶质瘤体外细胞模型.西妥昔单抗直接作用于胶质瘤细胞,更直观地显示了西妥昔单抗对不同级别胶质瘤细胞的作用效果,为西妥昔单抗在临床上的进一步应用提供了实验室依据.
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非酒精性脂肪肝离体细胞模型的建立
随着人们生活水平提高，非酒精性脂肪肝（ NAFL）及非酒精性脂肪性肝炎（ NASH）的发病率呈逐年上升趋势［1，2］，严重威胁人类健康。目前，对NAFL的研究常采用的是动物模型，但动物模型存在个体差异大，研究周期长，实验条件不易控制等不利因素。而细胞模型能较好地克服上述因素，有针对性地研究NAFL发病的细胞机制，且能进一步缩短药物干预的进程［3，4］。因此，建立NAFL体外细胞模型对研究其发病机制，为进一步防治NAFL具有重要的理论意义与广泛的实用价值。
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神经细胞损伤的细胞模型研究概况
在神经细胞损伤的保护药物的研究中,利用体外细胞模型进行药物的筛选成为重要的研究手段.主要结合神经细胞损伤的机制.综述了各种体外神经细胞损伤的细胞模型建立的方法,为开展中药及其方药防治脑血管痰病的研究提供合适的细胞模型.
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酶消化及差速贴壁法原代培养新生C57小鼠耳蜗膜蜗管外侧壁成纤维细胞
背景:目前对耳蜗膜蜗管外侧壁成纤维细胞的培养没有特定的方法.目的:采用酶消化与差速贴壁相结合的方法,原代培养新生C57小鼠膜蜗管外侧壁成纤维细胞,提供良好的体外细胞模型.方法:显微解剖分离新生C57小鼠膜蜗管外侧壁组织,对膜蜗管外侧壁组织进行胰蛋白酶消化与差速贴壁相结合的方法培养成纤维细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,苏木精-伊红染色,绘制细胞生长曲线,免疫组织化学染色鉴别细胞来源.结果与结论:膜蜗管外侧壁组织来源传代纯化的成纤维细胞呈梭形和三角形,生长曲线成S形,免疫组织化学检测波形蛋白,细胞胞浆中呈棕黄色阳性反应.结果证实培养出小鼠膜蜗管外侧壁成纤维细胞.
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α-细辛醚对无镁细胞外液培养海马神经元构建难治性癫痫细胞模型的影响
背景:无镁细胞外液处理培养的海马神经元可诱导产生反复自发性癫痫样放电,该模型可作为临床难治性癫痫细胞模型.目的:探讨难治性癫痫细胞模型中α-细辛醚对神经元的保护作用.方法:分离培养新生24 h 内的SD大鼠海马神经元,取经鉴定的海马神经元,加入含终浓度为7.5,15,30,60,120 mg/La-细辛醚的维持培养液培养4 h 后,换为无镁液建立难治性癫痫细胞模型,3 h后恢复含α-细辛醚的维持培养基继续培养24 h,MTT 法检测海马神经元活力.结果与结论:经无镁细胞外液培养后,海马神经元的活力显著降低(P < 0.01),α-细辛醚处理后,海马神经元的活力显著升高(P < 0.01),且随α-细辛醚浓度的增加,海马神经元的相对活力升高.说明α-细辛醚可以抑制难治性癫痫细胞模型中的神经元损伤,发挥神经元保护作用,且具有剂量依赖性.
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人骨肉瘤耐阿霉素细胞模型的建立及其生物学特性
背景:多药耐药是骨肉瘤化疗失败的重要原因,目前其耐药机制不明.目的:诱导建立耐阿霉素的人骨肉瘤细胞株并观察多药耐药蛋白1、多药耐药相关蛋白1和肺耐药蛋白的表达.方法:采用逐步递增阿霉素浓度间歇作用的方法诱导143B/WT细胞株建立143B/阿霉素耐药细胞株.结果与结论:经阿霉素诱导45 d建立了143B/阿霉素细胞株,其对阿霉素高度耐药,对顺铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺、长春新碱和紫杉醇亦产生不同程度交叉耐药;流式细胞仪检测显示与143B野生型细胞相比,143B/阿霉素细胞周期中G1和S期所占比例增加,而G2/M期所占比例明显减少;罗丹明外排实验显示,143B/阿霉素细胞药物外排能力显著高于143B/WT细胞(P < 0.01);流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察发现,143B/阿霉素细胞阿霉素相关性细胞凋亡率显著低于143B/WT(P < 0.01);Western blot检测显示143B/阿霉素细胞多药耐药蛋白1表达水平较143B/WT显著升高(P < 0.01),二者多药耐药相关蛋白1和肺耐药蛋白表达差异无显著性意义(P > 0.05).提示143B/阿霉素细胞多药耐药的产生与多药耐药蛋白1表达升高相关.
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新生C57小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的原代培养
背景:目前在原代细胞培养领域内,对耳蜗螺旋神经节细胞培养条件的报道各有差异,个别方法重复性较差,不利于实际应用.目的:原代培养并鉴定新生C57小鼠螺旋神经节细胞.方法:显微解剖分离新生C57小鼠蜗轴组织,经胰酶消化+差速贴壁+化学药物相结合方法培养;倒置相差显微镜及苏木精-伊红染色观察细胞生长状态,免疫组织化学染色鉴别细胞来源.结果与结论:蜗轴组织细胞纯化后,胞体呈椭圆形或三角形,有细长的突起,Nuen染色胞核呈棕黄色阳性反应,β3-Tubulin染色细胞胞浆与轴突均呈棕黄色阳性反应.提示实验成功培养出小鼠螺旋神经节细胞.
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人肝癌细胞胰岛素抵抗模型建立及有效中药成分的筛选
背景:目前,复方中药、单味中药在体内降糖作用及其降糖机制研究较多,但体外尤其是中药单体成分对胰岛素抵抗细胞有何影响尚不清楚.目的:体外建立人肝癌细胞(HepG2)胰岛素抵抗模型,并初步筛选可有效改善胰岛素抵抗的中药有效成分.方法:用不同浓度的胰岛素对HepG2细胞进行不同时间的诱导,通过MTT法对细胞活性评价及葡萄糖氧化酶法对HepG2细胞葡萄糖消耗量测定,明确建立稳定的HepG2胰岛素抵抗模型的胰岛素诱导浓度及诱导时间.模型建立后,应用不同浓度的齐墩果酸、药根碱、阿魏酸、大黄酸、马钱苷、葛根素、大豆苷分别作用于胰岛素抵抗细胞24 h,用葡萄糖氧化酶法分别观察不同浓度的上述中药成分对胰岛素抵抗模型HepG2细胞葡萄糖消耗的影响,MTT法对各组细胞活性进行评价.结果与结论:HepG2细胞在10-6 mol/L浓度的胰岛素中作用24 h,葡萄糖消耗量明显减少(P < 0.01),说明实验成功诱导出稳定人肝癌细胞胰岛素抵抗模型.10-5 mol/L浓度胰岛素组的胰岛素抵抗更明显(P < 0.01).各时间点10-5 mol/L浓度胰岛素作用的细胞成活率逐渐降低,死亡细胞增多(P < 0.05).齐墩果酸、药根碱、阿魏酸、大黄酸、马钱苷、葛根素、大豆苷均有改善细胞胰岛素抵抗的作用.其中,质量浓度2×10-1 g/L药根碱、大黄酸、葛根素和齐墩果酸,2×10-5 g/L马钱苷和阿魏酸对改善人肝癌细胞胰岛素抵抗效果较好(P < 0.01).
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人脐静脉内皮细胞胰岛素抵抗细胞模型的建立
背景:有研究表明血管内皮可能是胰岛素抵抗发生的首要环节.目的:采用高浓度胰岛素体外诱导培养法建立人脐静脉内皮细胞胰岛素抵抗模型.方法:以人脐静脉内皮细胞系为研究对象,应用含不同浓度胰岛素(50,40,30,20,10,1,0.1,0.01 U/L)的DMEM培养基与人脐静脉内皮细胞共同培养12,24,36,48,72 h,并设置正常组,光学显微镜下观察细胞形态学变化;MTT法测定各组细胞活性;用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法法鉴定胰岛素抵抗细胞模型.结果与结论:与正常组比较,当胰岛素浓度大于40 U/L,其作用时间大于48 h时,细胞形态受损严重,细胞活性显著下降(P < 0.01);当胰岛素浓度小于20 U/L,作用时间小于36 h时细胞形态无明显损伤(P > 0.05).葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法实验表明,在30 U/L的胰岛素刺激48 h条件下,培养液中残存葡萄糖浓度显著高于正常组细胞 (P < 0.01).证实,用含30 U/L胰岛素的培养基培养48 h的人脐静脉内皮细胞细胞可产生胰岛素抵抗.
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过氧化氢诱导体外损伤性白内障模型的构建及晶状体上皮细胞的凋亡
背景:氧化应激能够诱导晶状体上皮细胞发生凋亡.目的:观察Fas蛋白与过氧化氢诱发白内障中晶状体上皮细胞凋亡的关系以及表没石子儿茶素没食子酸酯对Fas蛋白表达及晶状体上皮细胞凋亡的影响.方法:将健康成年兔透明晶状体随机分为3组:空白对照组仅加入DMEM培养液,过氧化氢组加入DMEM+过氧化氢,表没石子儿茶素没食子酸酯组加入DMEM+过氧化氢+表没石子儿茶素没食子酸酯.结果与结论:各组体外培养72 h后过氧化氢组晶状体上皮细胞凋亡率及Fas蛋白阳性表达率显著高于空白对照组(P < 0.05).表没石子儿茶素没食子酸酯组晶状体上皮细胞凋亡率及Fas蛋白阳性表达率显著低于过氧化氢组(P < 0.05).结果显示,过氧化氢可能是通过上调Fas蛋白的表达诱导晶状体上皮细胞凋亡,而抗氧化剂表没石子儿茶素没食子酸酯可下调Fas蛋白的表达而减轻晶状体上皮细胞的凋亡.
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雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响
背景：雌激素受体β基因参与骨代谢的研究较少，其对骨代谢的具体调节机制仍不清楚。目的：分析雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响。方法：实验分3组：空白对照组(即hFOB 1.19，未感染任何反转录病毒)、阴性对照组(即含无效干扰片断雌激素受体β-shRNA-nc)、佳RNAi组(即ERβ-shRNA-3)。将前期佳RNAi组的雌激素受体β-shRNA反转录病毒载体感染人成骨细胞，通过抗性筛选并扩大培养，利用MTT法检测雌激素受体β稳定抑制后对细胞增殖的影响；随后在雌激素干预下，通过Western blot技术检测雌激素受体β蛋白表达的稳定抑制效率，并使用半定量RT-PCR和Western blot技术检测雌激素受体β稳定抑制后对转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响。结果与结论：①成功筛选出稳定感染ERβ-shRNA-3反转录病毒载体的人成骨细胞，MTT法检测显示雌激素受体β稳定抑制后对细胞的增殖没有明显影响(P>0.05)；②在雌激素干预下，雌激素受体β蛋白的抑制率为(93.11±0.57)%(P<0.05)，且雌激素受体β稳定抑制后对转化生长因子β1 mRNA和蛋白的上调率分别为(26.65±3.81)%和(23.79±3.76)%，骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白的上调率分别为(16.62±1.71)%和(18.08±3.20)%(均P<0.05)；③结果提示雌激素受体β可能通过调控转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2的表达在骨代谢中发挥作用。
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阿尔茨海默病细胞模型中β淀粉样蛋白介导ERK信号通路的STEP61负性调控
背景:研究表明纹状体富集的酪氨酸磷酸酶61(striatal-enriched phosphatase,STEP61)在突触可塑性方面发挥重要作用.STEP位于后突触末端,影响突触增强的形成,可能的机制是使关键性信号蛋白如MAPK激酶ERK1/2去磷酸化并失活.目的:探讨STEP61负性调控阿尔茨海默病细胞模型中β淀粉样蛋白介导的ERK信号通路的机制.方法:实验分3组,正常组为C57BL/6小鼠原代皮质神经元细胞;阿尔茨海默病细胞模型组是利用1μmol/L凝聚态的β淀粉样蛋白1-42加入皮质神经元细胞中1 h作为阿尔茨海默病细胞模型;β淀粉样蛋白1-42+RNAi组为在阿尔茨海默病细胞模型基础上,利用sRNAi技术制作STEP61基因沉默组.应用Western Blot技术检测STEP61的RNAi对ERK信号通路的影响.结果与结论:Western blot结果显示,阿尔茨海默病细胞模型组与正常组相比STEP61蛋白表达增加了223％(P<0.05),使磷酸化STEP61的比例减少到(75.6±4.6)％(P<0.05).β淀粉样蛋白1-42+RNAi组STEP61磷酸化的比例与阿尔茨海默病细胞模型组相比差异无显著性意义.同时阿尔茨海默病细胞模型组pERK1/2的蛋白表达量较对照组减少(P<0.05),而β淀粉样蛋白1-42+RNAi组pERK1/2的蛋白表达量较阿尔茨海默病细胞模型组显著增加(P<0.05).结果说明:在阿尔茨海默细胞模型中证实了STEP61调控β淀粉样蛋白介导的ERKs活性,并且很可能是通过脱磷酸化使他们失活而实现的.
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体外构建三维肝肿瘤模型及药物筛选
背景：体外构建三维肿瘤模型替代现有二维平面肿瘤细胞模型用于药物筛选是肿瘤药筛技术发展的必然趋势。
目的：体外构建三维肝肿瘤模型体系，并用于抗肿瘤药物的敏感性研究。
方法：以人肝癌细胞HepG2作为模型细胞，以壳聚糖/胶原混合材料制备水凝胶支架，体外构建肝(肿瘤)细胞的三维培养体系，表征三维肝(肿瘤)细胞聚集体的形态、生长、细胞骨架分布等，并以二维平面培养的肝肿瘤细胞为对照，研究三维肝肿瘤模型对临床常用的化疗药物的敏感性。
结果与结论：①肝细胞在壳聚糖/胶原水凝胶支架中培养10 d后形成三维的聚集细胞团。②肝细胞在水凝胶支架中生长速度略慢于二维平面培养，但在三维体系下肝细胞能长时间保持细胞活性。③在水凝胶支架中肝细胞三维生长后，纤维蛋白骨架发生重排，结构与在体肝组织更接近。④在水凝胶支架中的三维肝肿瘤细胞模型对化疗药物的敏感性降低。由此可见，在壳聚糖/胶原水凝胶支架中形成的三维肝(肿瘤)模型，其细胞骨架结构更接近体内肝组织，因此可用于体外药筛模型研究。 -
博尔纳病病毒磷蛋白细胞模型的构建与鉴定
目的 建立博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)磷蛋白的细胞模型,并对所建模型进行鉴定.方法 重新扩增和鉴定已有的BDV 磷蛋白(GFP-P24)质粒,使用转染试剂将该质粒转入PC12细胞,并用荧光定量PCR和ELISA的方法对所构建的细胞模型进行鉴定.结果 重新扩增的质粒PCR鉴定阳性,其浓度符合转染的需要,测序后未发现核苷酸的突变;转染PC12细胞的效率高,荧光定量PCR和ELISA检测均为阳性.结论 成功构建了BDV磷蛋白的细胞模型,为研究BDV感染过程中磷蛋白所起的作用奠定了基础.
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两种博尔纳病病毒株持续感染PC-12细胞模型的建立
目的 构建两种博尔纳病病毒株持续感染的PC-12细胞模型,为研究博尔纳病病毒感染致病机制及比较两种病毒株致病特点的差别提供工具.方法 将BDV Strain V株和Hu株分别感染PC-12细胞系,并进行传代培养,后通过Real time FQRT-PCR、Western blot、间接免疫荧光方法进行病毒核酸和蛋白的检测.结果 在培养传代6代后,两种病毒株感染的PC-12细胞均可检测到BDV核酸及蛋白.结论 BDV Strain V株和Hu株均可在PC-12细胞中复制和表达,两种博尔纳病病毒株持续感染PC-12细胞模型构建成功.
