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FLT3配基在人骨髓基质细胞系中的基因转移与表达
目的：研究逆转录病毒介导的 FL在骨髓基质细胞系 HFCL中的表达。 方法：采用脂质体法将重组质粒 pLFSN／HFCL和空载体 pLXSN／HFCL转染包 装细胞PA317，G418筛选抗性克隆，用抗性克隆上清液感染 HFCL。RT-PCR和基因组 DNA-P CR检测外源基因mRNA水平的表达及染色体的整合，小鼠CFU-GM集落法检测FL生物学活性。 结果：在mRNA水平有FL的表达，染色体基因组中整合有标记neo基因和FL基 因。活性测试结果显示转染的骨髓基质细胞分泌FL。结论：提示骨髓基质细 胞可作为基因治疗的靶细胞。
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阳离子脂质体介导hFL真核表达载体在骨髓基质细胞系中的表达*
目的:阳离子脂质体介导hFL真核表达载体pIRESlneo/hFL转染人骨髓基质细胞系HFCL细胞,观察hFL在HFCL细胞中的表达.方法:以阳离子脂质体介导法将重组真核表达载体pIRESlneo/hFL导入人骨髓基质细胞系HFCL细胞,G418筛选获得的阳性细胞以Southem blot和Northern blot分别检测其基因组DNA整合和mRNA转录,Western blot检测其蛋白表达,ELISA及人脐血CD34+细胞增殖实验检测其蛋白表达量和活性.结果:hFL基因己整合到靶细胞HFCL基因组DNA中,在mRNA和蛋白质水平上均可检测到其表达,ELISA法测得hFL的表达量为(60.3±0.3)ng.106Cell-1@d-1,分泌量在细胞传代30次后仍保持稳定,并且表达的hFL具有良好的生物学活性.结论:阳离子脂质体介导的hFL真核表达载体在人骨髓基质细胞系HFCL中获得持续稳定表达,并具有良好的生物学活性.为转基因骨髓基质细胞移植促进造血重建的体内动物实验研究奠定了基础.
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Nfic基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与miR-20a靶向关系的验证
目的：构建核因子C（nuclear factor I-C，Nfic）基因3′非编码区（3′UTR）荧光素酶报告质粒，利用双荧光素酶报告基因验证microRNA-20a（miR-20a）与其潜在靶基因Nfic的靶向关系。方法通过microRNA靶基因预测软件Targetscan获取miR-20a与Nfic基因3′UTR潜在的互补结合位点；PCR扩增出Nfic基因3′UTR序列，将此序列克隆至荧光素酶报告载体pMIR-Report Luciferase；将重组荧光素酶报告质粒与miR-20a mimics（实验组）或NC mimics（对照组）共同转染293-AD细胞，收集细胞后通过双荧光素酶报告系统检测2组细胞的荧光素酶活性，从而对Nfic与miR-20a的靶向调节关系进行鉴定。将miR-20a mimics和NC mimics分别转染骨髓基质细胞系ST2，裂解细胞提取蛋白后采用Western blotting检测NFIC蛋白的表达水平。结果构建的重组荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确。双荧光素酶报告基因检测显示，与对照组相比，miR-20a可以抑制Nfic 3′UTR报告基因载体的荧光素酶活性（P<0.05）；Western blotting结果显示，与对照组相比，ST2细胞转染miR-20a mimics后NFIC蛋白表达水平明显下调。结论成功构建了Nfic基因3′UTR荧光素酶报告质粒,而miR-20a可以直接作用于Nfic基因3′UTR，抑制其荧光素酶活性。
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转hGM-CSF基因骨髓基质细胞在体外扩散盒中的表达
目的研究转人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因骨髓基质细胞系在体外扩散盒中的表达.方法采用阳离子脂质体介导法将构建好的真核表达载体pIRESIneo/hGM-CSF导入人骨髓基质细胞系HFCL,建立转基因人骨髓基质细胞系HFCL/hGM-CSF,用Southern blot和Northern blot方法分别检测其基因组DNA整合和mRNA转录,并将其移入体外扩散盒中,用ELISA法检测其蛋白表达量.结果Southern blot和Northem blot分析表明hGM-CSF基因已整合到HFCL细胞基因组DNA中,在mRNA水平上可以检测到其表达,移入扩散盒的HFCL/hGM-CSF细胞稳定分泌hGM-CSF,量为51.6±0.5 ng/106细胞/天.结论转hGM-CSF基因骨髓基质细胞可以在体外扩散盒中持续稳定表达hGM-CSF,为进一步体内实验奠定了基础.
关键词： 粒-巨噬细胞集落刺激因子 骨髓基质细胞系 基因表达 扩散盒 -
促红细胞生成素促进骨髓基质细胞成骨分化的实验研究
目的:研究促红细胞生成素(EPO)通过ephrinB2/EphB4信号通路在细胞成骨分化中的作用.探讨EPO在骨稳态中的作用及其机制.方法:体外培养小鼠骨髓基质细胞系(ST2),加入EPO后,采用real-time PCR方法检测EphB4的表达以及成骨细胞相关基因的表达,采用ALP活性检测和茜素红染色观察EPO对成骨细胞功能的影响;在体外培养的ST2细胞中加入ephrinB2-Fc蛋白,模拟破骨细胞-成骨细胞共培养,使ephrinB-EphB4正向信号激活,采用上述方法检测其对成骨细胞的影响;进一步采用RNAi技术,使EphB4基因沉默,检测EPO对成骨细胞的影响.结果:EPO能增加ST2细胞RUNX2 、ALP和Col1等成骨细胞相关基因的表达,同时伴随ST2细胞表面EphB4的表达升高,ALP活性和钙结节也增加;在模拟破骨细胞-成骨细胞共培养体系中,EPO也能促进ST2细胞的成骨向分化和功能;EphB4基因沉默后,EPO对ST2细胞的作用被减弱.结论:EPO能促进成骨细胞的分化和功能,该作用是通过ephrinB2/EphB4信号介导的.
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儿童骨髓基质细胞系免疫细胞化学初步研究
目的了解儿童骨髓基质细胞的起源、组成及传代过程中的细胞骨架.方法采用体外培养和免疫细胞化学染色技术,观察波形纤维蛋白(Vimentin)、结蛋白(Desmin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin)和VIII因子相关抗原(Von Willebrand Factor)在儿童骨髓基质细胞系中的表达.结果 Vimentin在原贴壁基质细胞系由原代传至5代的细胞中,其表达逐渐下降,而在再贴壁基质细胞传至第3代中表达高;Desmin、α-Smooth Muscle Actin单克隆抗体和Von Willebrand Factor抗体染色呈阴性.结论本结果提示本文中骨髓基质细胞来源于间充质,Vimentin的表达与细胞的分化、增殖有关,体外培养时骨髓基质细胞的组成、分化可能与培养条件有关.
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转IL-3基因的骨髓基质细胞体外对造血功能的促进作用
目的探讨用逆转录病毒载体转入mIL-3基因的基质细胞系QXMSC1对骨髓造血细胞前体的影响.方法用含鼠IL-3基因的逆转录病毒载体感染骨髓基质细胞系QXMSC1,获得IL-3高表达细胞系QXMSC1 IL-3用于实验.观察QXMSC1 IL-3细胞上清对骨髓前体细胞CFU-GM、CFU-E、CFU-GEMM的影响,QXMSC1 IL-3基质细胞对长期培养起始细胞的影响.结果 QXMSC1 IL-3培养上清对骨髓前体细胞、CFU-GM、CFU-E、CFU-GEMM有明显促进作用.QXMSC1 IL-3能明显增加有核细胞数和长期培养起始细胞数,诱导分化形成CFU-GM增多.阻断基质细胞与造血细胞相互接触,QXMSC1IL-3促造血细胞增殖作用有所减弱.结论基质细胞QXMSC1 IL-3可能作为有效的基因载体进一步促进骨髓移植后或辐射损伤后的造血和免疫功能重建.
