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人白介素24基因重组腺病毒载体的构建与鉴定
目的 构建含有人白介素24(hIL-24)基因的重组腺病毒载体,为下一步病理性瘢痕的基因治疗研究奠定实验基础.方法 采用基因工程技术将hIL-24基因的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,鉴定正确后在PAdEasy系统中进行细菌内同源重组,通过脂质体将正确重组体包裹并转染293A细胞以包装并扩增病毒.采用酶切及PCR方法对重组腺病毒进行鉴定.结果 酶切和PCR结果证实hIL-24基因重组腺病毒载体构建成功并可在293A细胞中表达,病毒滴度达107pfu/ml.结论 成功构建了有较强感染能力的含hIL-24基因的重组腺病毒载体.
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hIL-24基因通过调控转化生长因子β/Smad通路影响瘢痕疙瘩的生物学特性
背景：hIL-24基因是研究较明确的肿瘤抑制基因，既可以表达免疫系统刺激蛋白，刺激免疫应答效应，又能特异性地抑制肿瘤细胞生长，抑制肿瘤血管形成，诱导肿瘤细胞凋亡。目的：分析hIL-24对瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制增殖和诱导凋亡的作用及机制。方法：经临床及病理确诊为瘢痕疙瘩13例，取瘢痕疙瘩组织进行成纤维细胞培养和鉴定。实验分为对照组(瘢痕疙瘩组织成纤维细胞)和转染hIL-24的瘢痕疙瘩成纤维细胞组。构建慢病毒载体(LVTHM)将hIL-24基因转染瘢痕疙瘩组织成纤维细胞，观察转化生长因子β、Smad3、增殖细胞核抗原、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶抑制物1基因表达情况。结果与结论：①细胞免疫荧光染色及细胞流式显示培养的成纤维细胞内胞浆波形蛋白抗体呈阳性，纯度大于97.8%；定量PCR检测成纤维细胞hIL-24的过表达效率为81.7%；②Western blot检测转梁的成纤维细胞表达hIL-24明显增加；③定量PCR检测，对照组转化生长因子β、Smad3、增殖细胞核抗原、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9表达明显高于转染hIL-24的瘢痕疙瘩成纤维细胞组(P<0.05)，基质金属蛋白酶抑制物1表达明显低于转染hIL-24的瘢痕疙瘩成纤维细胞组；④结果提示，hIL-24抑制成纤维细胞增殖细胞核抗原、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9表达，其作用机制可能是通过转化生长因子β/Smad3转导途径。
关键词： 组织构建 组织工程 瘢痕疙瘩 hIL-24 TGF-β/Smad -
HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因联合诱导人宫颈癌Ca Ski细胞的凋亡
目的:观察HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因体外共转染,联合诱导人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的效应.方法:HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因的质粒载体分别以单独或联合的方式转染人宫颈癌Ca Ski细胞,随后利用RT-PCR技术检测细胞中HPV-16E6癌基因的mRNA水平变化;Western blot分析细胞中抑癌蛋白p53水平的变化;流式细胞技术分析细胞凋亡情况.结果:经HPV-16 E6 siRNA和hIL-24转染后细胞后HPVE6癌基因的mRNA水平均下降,其中联合转染组显著下降(P＜0.05);抑癌蛋白p53水平均增高,其中联合转染组显著增高,细胞凋亡率均升高,其中联合转染组显著升高(P＜0.05).结论:HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因分别转染宫颈癌Ca Ski细胞后,均能抑制Ca Ski细胞中HPV-16E6癌基因的表达,使抑癌蛋白p53恢复活性,诱导宫颈癌Ca Ski细胞凋亡;两者联合则具有协同效应,能显著提高肿瘤细胞凋亡率.
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含hIL-24重组腺病毒载体(Ad-mda-7/hIL-24)的构建及其对喉癌细胞Hep2增殖的影响
目的 构建含有人白细胞介素24( hIL-24)的腺病毒表达载体(Ad-mda-7/hIL-24),观察其对喉癌细胞Hep2增殖的影响.方法 提取IL-24cDNA克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,采用pAdEasy系统进行细菌内同源重组得到含目的基因的腺病毒载体,脂质体转染293A细胞进行包装并扩增病毒.PCR和Western blot方法鉴定重组腺病毒,四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察其对Hep2增殖的影响.结果 成功构建Ad-mda-7/hIL-24,滴度达107 pfu/mL,MTT检测表明Ad-mda-7/hIL-24可明显抑制Hep2细胞生长.结论 构建有较强感染能力的Ad-mda-7/hIL-24,并能显著抑制Hep2细胞增殖,为研究其作用机制及将其用于喉癌的基因治疗提供了实验和理论依据.
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重组腺病毒载体pDC316-hIL-24的构建及病毒滴度测定
目的 构建重组腺病毒载体pDC316-hIL-24,并测定病毒滴度.方法 从HEK293细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-24基因全编码区序列.将测序正确的片段用BglⅡ和HindⅢ双酶切定向插入到pDC316-EGFP穿梭质粒中.构建重组穿梭质粒pDC316-EGFP-hIL-24,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC316-hIL-24,经HEK293细胞扩增,TCID50法测定重组腺病毒滴度.结果 成功构建出表达hIL-24基因的重组腺病毒载体(pDC316-hIL-24),获得了高滴度表达hIL-24基因的重组腺病毒.结论 重组腺病毒表达载体(pDC315-hIL-24)的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肿瘤的转基因治疗研究.
关键词： hIL-24 重组腺病毒载体 病毒滴度 pDC316-hIL-24
