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DMD散发型病例产前诊断对策
目的杜氏/贝氏肌营养不良症的散发病例的产前诊断分析,为临床服务提供依据.方法采用DMD/BMD基因的5'启动子区域、基因缺失热区的内含子及基因的3'不翻译区的多个短串联重复序列(STR)位点进行缺失检测和单体型连锁分析.结果应用此诊断程序可检测到大部分的缺失病例,对于非缺失病例,可以通过单体型连锁分析确定(风险)基因的标记.无家族史的散发病例中新生突变可发生在不同的层次上,新生突变可发生于男性生殖腺中;在产前诊断中,对获得风险染色体标记的男性胎儿要慎重对待.结论散发病例中基因突变可发生在不同世代,父源的生殖腺嵌合值得注意.
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外显子组测序在抗肌萎缩蛋白基因检测到一个新的剪接供体位点突变
目的 应用外显子组捕获和第2代测序技术检测抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin)中的微小突变.方法 通过外显子组捕获和第2代测序技术对1例具有典型杜氏肌营养不良症(DMD)临床表现但没有外显子缺失或重复的患者进行dystrophin基因突变检测,并用Sanger测序证实检测结果.以生物信息学预测基因突变所致该基因编码情况的改变.以患者母亲和100名体检正常者作为对照.结果 在患者dystrophin基因内含子50的第1个碱基检测到1个碱基改变:G＞C,其母亲在相同的位置发生了杂合改变.生物信息学预测此改变将使内含子50原有的5'剪接位点消失,导致其相应肽链C端氨基酸序列改变、终止密码提前出现.Sanger测序进一步证实了该突变的存在,且在正常对照未检测到该突变.这是在dystrophin基因上新发现的致病性剪接供体位点突变.结论 外显子组测序技术可有效检测dystrophin基因微小突变,其应用可进一步完善DMD分子诊断体系.
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2个中国汉族假肥大型进行性肌营养不良家系分析
目的·通过分析2个中国汉族假肥大型进行性肌营养不良家系的基因变异,提高对本病的认识.方法·回顾性分析2个假肥大型进行性肌营养不良家系中先证者的临床特征,以及先证者及其亲属的多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)检测结果.结果·3个携带抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin gene,DMD基因)变异的假肥大型进行性肌营养不良先证者均有血清肌酸激酶异常升高,家系1中异卵双生的兄弟2人均为DMD基因8～9号外显子缺失,其母该位点未见异常.家系2中异卵双生之弟为DMD基因48～51号外显子重复,其母为该位点的杂合变异.结论·①异卵双胎存在相同DMD基因突变的家系,若其母亲外周血基因检测正常,则提示其母亲可能为该突变的生殖腺嵌合体,再次生育时须进行产前基因诊断来降低后代患假肥大型进行性肌营养不良的风险.②DMD基因48 ～ 51号外显子重复为致病突变.
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中国一进行性肌营养不良家系相关致病基因Dystrophin突变检测结果分析
目的 探讨进行性肌营养不良(DMD)家系相关致病基因Dystrophin基因突变情况.方法 收集一个DMD家系的临床资料,采用聚合酶链反应及直接测序法对此家系成员进行Dystrophin基因突变检测,同时对140例家系外健康对照者的该基因位点进行限制性核酸内切酶分析(PELP).结果 在DMD家系中先证者(DMD患者1例)发现了一个纯合变异基因,即Dystrophin基因59号外显子上发现一个错义变异(G9017A),导致代表精氨酸的2937位密码子转变为为谷氨酰胺(R2937Q).在健康对照者中未发现此位点的变异.结论 在一个中国DMD家系先证者的Dystrophin基因上发现了一个尚未报道的基因突变位点.
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缺失型Duchenne型肌营养不良症基因连接片段的BAC克隆和断裂点的分子结构特征
目的分析缺失型Duchenne型肌营养不良症(DMD)缺失热区第46号外显子缺失后形成的连接片段的断裂点的分子结构特点,并分析分子结构特点与内含子高不稳定性及外显子缺失的关系.方法多重引物PCR法鉴定第46号外显子缺失的DMD患者,用BAC载体克隆第46号外显子缺失后形成的连接片段,测定断裂点侧翼的核苷酸序列.结果第46号外显子缺失后,5'端断裂点位于45号内含子的AT富含区内.3'端断裂点位于46号内含子MER1类重复序列内.连接片段有两个bp的连接同源序列ta,局部无小的缺失、插入和碱基的置换.第46号外显子缺失后连接片段的断裂点的二级结构分析示断裂点均位于单链发夹环的非匹配区.结论第46号外显子缺失后形成的连接片段,其断裂点的共同特征是均位于重复序列,这些重复序列形成的单链发夹结构,使DNA结构具有不稳定性,易于断裂并导致外显子缺失.
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多重连接探针扩增技术对1个假肥大型中国汉族肌营养不良症家系的遗传学研究
目的 拟通过多重连接探针扩增技术(MLPA)对1个假肥大型进行性肌营养不良(DMD)家系进行检测以明确DMD的诊断,结合患者临床表现进行分析并对MLPA技术用于DMD临床诊断进行探讨.方法 收集1个DMD患者家系,该家系共12人,男性患者2例.分离外周血并提取DNA,用MLPA的方法对其进行基因诊断.结果 先证者符合DMD诊断.基因检测提示先证者和其弟弟携带抗肌萎缩蛋白基因缺失突变DMD(Exon3-11).先证者母亲为致病基因携带者.结论通过MLPA检查技术明确了一个中国汉族DMD家系的致病基因,MLPA技术能够用于DMD疾病的诊断.
关键词： 假肥大型肌营养不良 家系 基因分析 多重连接探针扩增技术 抗肌萎缩蛋白基因 -
克隆缺失连接片段——一种基于PCR技术的缺失型假肥大型肌营养不良症的携带者检测
目的 依据dystrophin基因缺失后断端重接可形成一段变异的DNA序列,提出一种利用缺失连接片段进行缺失型假肥大型肌营养不良症携带者检测的新方法.方法 实验以来自广东省肇庆地区的一个Becker型肌营养不良(Becket muscular dystrophy,BMD)家系为研究对象,其中2例确诊的男性BMD患者,3例待诊的女性携带者,1例待诊的人工流产绒毛.先证者经外显子PCR检测确定第3～5外显子缺失,随后采用PCR步移法在相应内含子设计引物定位断裂点的位点,后利用靠近断裂点设计的引物直接对家系的6例基因组DNA进行缺失连接片段的PCR扩增和测序.结果 6例基因组DNA均扩增出阳性的产物片段且连接片段的测序序列完全一致,绒毛的性别诊断结果为女性,可以确诊本家系中的3个女性和流产绒毛均为缺失型BMD携带者.结论 作者成功地将整个家系患者和携带者的缺失连接片段进行克隆和测序分析,实现了利用缺失连接片段对缺失型假肥大型肌营养不良症携带者进行准确基因诊断的设想,同时对在产前诊断上的应用前景进行了探讨.
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缺失型杜氏肌营养不良症缺失热区内含子断裂点分子结构特点的对比分析
目的对比分析缺失型杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)缺失热区第46号和51号外显子缺失后形成的连接片段的断裂点的分子结构特点,以研究DMD基因外显子的缺失机理.方法多重引物PCR法鉴定缺失型DMD患者,分别克隆第46、51号外显子缺失后形成的连接片段,测定断裂点侧翼的核苷酸序列.结果第46号外显子缺失后,5′端断裂点位于45号内含子的AT富含区内.3′端断裂点位于46号内含子的中等重复序列(medium reiteration repeats,MER1)内.连接片段有两个bp的连接同源序列ta,局部无小的缺失、插入和碱基的置换.第51号外显子缺失后,5′端断裂点位于50号内含子的人类类转座因子(transposon-like human elements,THE1)序列内.3′端短裂点位于51号内含子L2序列内.连接片段有3个bp的连接同源序列cta,局部无小的缺失、插入和碱基的置换.第46、51号外显子缺失后连接片段的断裂点的二级结构分析示断裂点均位于单链发夹环的非匹配区.结论对比第46、51号外显子缺失后形成的连接片段,其断裂点的共同特征是均位于重复序列,这些重复序列形成的单链发夹结构,使DNA结构具有不稳定性,易于断裂并导致外显子缺失.
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抗肌萎缩蛋白基因非缺失/重复突变引起的Becker型肌营养不良症的研究
目的 探讨Becker型肌营养不良症(Becker muscular dystrophy,BMD)的基因突变类型,增加对抗肌萎缩蛋白基因非缺失/重复突变引起BMD的认识.方法 收集2例BMD患者的临床资料,应用多重连接依赖式探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification assay,MLPA)方法对抗肌萎缩蛋白基因进行分析,并对其肌肉进行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、抗肌萎缩蛋白(dystrophin)染色及电镜检测.结果 2例患者经MLPA方法检测抗肌萎缩蛋白基因均呈非缺失/重复突变类型,肌肉活检光镜和电镜均呈肌营养不良改变.例1患者染色示肌膜dystrophin大部分呈不连续弱阳性,部分为阴性.例2患者染色示肌膜dystrophin-C为阴性,dystrophin-N为阳性.结论 对于抗肌萎缩蛋白基因非缺失/重复突变的临床症状较轻的患者,进行肌肉活检和抗肌萎缩蛋白免疫组化将有助于明确诊断BMD及判断其预后.
