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冬凌草甲素通过线粒体途径诱导人胆囊癌GBC-SD细胞凋亡
目的 研究冬凌草甲素诱导人胆囊癌GBC-SD细胞的凋亡作用及其机制.方法 MTS法检测冬凌草甲素对GBC-SD细胞的生长抑制作用；瑞氏染色法观察细胞的形态学变化；流式细胞仪检测细胞凋亡率、线粒体膜电位改变、caspase-3活性变化；Western blot检测caspase-9活化情况.结果 冬凌草甲素能显著抑制GBC-SD细胞增殖,呈时间剂量依赖性(P＜0.05).细胞形态学观察可见冬凌草甲素可诱导细胞发生凋亡.流式细胞仪检测结果显示28 μmol/L药物处理GBC-SD细胞24h后,细胞凋亡率为51.28％±2.65％.随着药物浓度增加,GBC-SD细胞线粒体膜电位逐渐下降而caspase-3活性逐渐增强,56μmol/L组caspase-3活性是对照组的11倍.Western blot分析结果显示caspase-9酶原被激活,且活化条带随药物浓度的增加而增强.结论 冬凌草甲素可能通过细胞线粒体膜电位下降激活caspase-3并终诱导GBC-SD细胞凋亡.
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茶多酚诱导人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞凋亡的机制
目的 探讨茶多酚体外诱导人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞凋亡的机制.方法 茶多酚作用GBC-SD细胞48 h后,光学显微镜观察细胞形态变化；Hoechst33258/PI双染色,激光扫描共聚焦显微镜观察茶多酚诱导人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞凋亡作用；DCFH-DA为细胞内活性氧探针,激光扫描共聚焦显微镜检测茶多酚对人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞活性氧(ROS)水平的影响,分光光度法测定茶多酚对人胆囊癌细胞系GBCSD细胞内caspase-3活性的影响.结果 50、100、200 μg/ml茶多酚作用GBC-SD细胞48h后,人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞呈现典型的凋亡特征；激光扫描共聚焦显微镜下观察茶多酚作用后GBC-SD细胞ROS明显上升,细胞内caspase-3活性增强(P＜0.01).结论 茶多酚能显著诱导人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞发生凋亡作用,其机制口可能是ROS过量积聚、激发caspase级联反应,从而诱导细胞凋亡.
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茶多酚诱导人胆囊癌细胞GBC-SD凋亡过程中细胞内游离钙离子浓度及线粒体膜电位的变化
目的 探讨茶多酚(Tea polyphenols,TP)诱导人胆囊癌细胞GBC-SD凋亡过程中细胞内游离钙离子浓度[Ca+]；及线粒体膜电位(△ψm)的变化.方法 采用MTT法检测TP对GBC-SD细胞增殖的影响；Annexin V-FITC/PI双染色,激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning cofocal microscopy,LSCM)观察TP对GBC-SD细胞凋亡的影响；Fluo-3 AM和Rhodamine123染色标记,LSCM观察TP对GBC-SD细胞内[Ca2+]i及△ψm的影响.结果 TP可明显抑制GBC-SD细胞增殖,并诱导细胞凋亡,且呈时间和剂量依赖性；TP能使GBC-SD细胞内[Ca2+].增加,△ψm降低,且呈剂量和时间效应关系.结论 TP对GBC-SD细胞具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用,其机制可能与其上调细胞内[ Ca2+]i、降低△ψm有关.
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共干扰Hpa、EP-CAM对人胆囊癌细胞株裸鼠模型的实验研究
目的:研究miRNA转染乙酰肝素酶(heparanase,Hpa)和上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EP-CAM)对胆囊癌裸鼠移植瘤的体内抑瘤作用.方法:通过脂质体转染法将含Hpa、EP-CAM的真核表达质粒分别及共同转染至人胆囊癌细胞株GBC-SD,MTT法检测体外细胞增殖情况,筛选出干扰稳定表达细胞株后,采用裸鼠腋外侧皮下注射方法进行裸鼠体内成瘤实验,连续40 d观察裸鼠体表胆囊癌移植瘤生长情况.结果:单独及共同干扰组细胞生长受到明显抑制,而共同干扰组作用尤为突出.裸鼠体内实验提示Hpa miRNA组、EP-CAM miRNA组、共干扰组抑瘤率分别为69.06%、64.94%、85.67%.Hpa、EP-CAM基因蛋白在干扰组表达均明显低于正常胆囊癌细胞接种组(P<0.01).结论:采用RNAi法沉默Hpa和EP-CAM在胆囊癌细胞中的表达可有效抑制其在体内外的生长,并且以共同干扰效果尤为突出.
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人胆囊癌细胞系GBC-SD p53基因突变的研究
目的:从蛋白质和分子水平研究人胆囊癌细胞系GBC-SD p53基因状况.方法:对体外培养的GBC-SD细胞,应用免疫细胞化学SP法定性了解其P53蛋白的表达情况;用PCR技术扩增GBC-SD细胞p53基因4～9外显子,对所得产物进行直接测序分析.结果:GBC-SD细胞P53蛋白过表达;PCR产物第5外显子126位密码子有TAC→AAC的碱基颠换,因而使其编码的氨基酸从酪氨酸→天冬酰胺,产生错义突变.结论:人胆囊癌细胞系GBC-SD表达突变型P53蛋白,点突变是其p53基因功能失活的主要原因.
