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p62/SQSTM1在破骨细胞中信号传导通路的研究进展
p 62/SQSTM 1是一种多功能泛素结合蛋白及信号转导途径中的支架和适配子蛋白,其分子结构中的多个功能结构域可与其它蛋白质相互作用,介导多种细胞功能.在破骨细胞中,p 62/SQSTM 1信号传导通路对破骨细胞的激活及分化等发挥重要作用.因此,p 62/SQSTM 1与骨质疏松、Paget骨病等的发病机制密切相关.本文主要从p 62/SQSTM 1的概述及在破骨细胞中的相关信号传导通路等做一综述,旨在为骨质疏松、Paget骨病等相关骨骼疾病的研究提供参考.
关键词： p62/SQSTM1 破骨细胞 信号传导通路 骨质疏松 Paget骨病 -
pCMV6-Entry p62真核表达质粒构建及高表达稳定细胞系的建立
[目的]构建pCMV6-Entry p62真核表达质粒,并将其转染至人乳腺癌细胞株MCF-7中,通过抗生素筛选构建高表达p62的稳定细胞系.[方法]以293ET细胞cDNA为模板,设计引物扩增p62基因片段,双酶切扩增出的目的基因片段及pCMV6-Entry Vector空载体,将酶切后的片段进行连接,转化构建质粒,酶切及测序验证；将构建好的质粒转染入MCF-7细胞株中,G418筛选稳定表达细胞株,并用实时定量PCR和Western blotting进行验证.[结果]酶切及测序结果证实成功构建pCMV6-Entry p62真核表达质粒；实时定量PCR结果显示,与对照组相比,转染p62的MCF-7稳定细胞中p62 mRNA的表达显著升高；Western blotting检测Flag及p62蛋白表达显示,在转染p62的MCF-7稳定细胞检在62 kd位置测到Flag阳性条带,对照组则没有阳性条带.在转染p62的MCF-7稳定细胞中p62蛋白的表达较对照组显著升高.[结论]成功构建了pCMV6-Entryp62真核表达质粒,并成功建立高表达p62的MCF-7稳定细胞系.
关键词： p62/SQSTM1 自噬受体 真核表达质粒 MCF-7 -
microRNA-424-5p对人胃癌细胞SGC-7901自噬的影响及机制
目的 研究microRNA-424-5p[miR-424-5p)对人胃癌细胞SGC-7901自噬的影响及可能机制.方法 培养人正常胃黏膜上皮细胞GES和人胃癌细胞SGC-7901,应用实时定量PCR方法检测miR-424-5p的表达水平;应用Lipofectamine (R)LTX试剂将化学合成的miR-424-5pagomir和miR-424-5p antagomir转染人胃癌细胞SGC-7901,验证转染效率后应用MTT方法检测细胞活力;应用免疫荧光法检测自噬标记物微管相关蛋白轻链-3(LC3)和自噬降解底物p62/SQSTM1在SGC-7901细胞的分布;应用Western blot方法检测LC3-Ⅱ、p62/SQSTM1和自噬相关蛋白Beclinl的蛋白表达水平.结果 miR-424-5p在人胃癌细胞SGC-7901中呈低表达,miR-424-5p过表达显著抑制人胃癌细胞SGC-7901的细胞活力,miR-424-5p表达沉默的作用效果与之相反.miR-424-5p过表达后自噬标记物LC3在SGC-7901细胞的胞浆内呈点状分布,荧光表达显著增强,并且LC3-II的蛋白表达水平显著上调,同时伴有自噬降解底物p62/SQSTM1在细胞浆内荧光表达显著减弱,蛋白表达下调,此外,自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达水平显著上调;miR-424-5p表达沉默的作用效果与之相反.结论 miR-424-5p过表达明显抑制人胃癌细胞SGC-7901的细胞活力,诱导细胞发生自噬,其机制之一可能与自噬相关蛋白Beclin1上调有关.
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内皮-单核细胞激活多肽对人U118胶质瘤细胞自噬的影响及机制
目的 研究内皮-单核细胞激活多肽(EMAP-Ⅱ)对人U118脑胶质瘤细胞自噬的影响及可能机制.方法 EMAP-Ⅱ处理人U118胶质瘤细胞后,采用MTT检测细胞活力;用免疫荧光法检测自噬标记物微管相关蛋白轻链-3 (LC3)在U118细胞的分布;Western blot方法检测LC3-Ⅱ、自噬降解底物p62/SQSTM1和自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达水平.结果 与EMAP-Ⅱ 0 h组相比,0.05 nmol·L-1剂量以上的EMAP-Ⅱ可明显抑制人U118胶质瘤细胞的活力,降低线粒体膜电位(MMP),在EMAP-Ⅱ作用0.5 h时效果明显;自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)能够阻断EMAP-Ⅱ的作用,使细胞活力和线粒体膜电位基本恢复;EMAP-Ⅱ作用0.5 h后自噬标记物LC3在胞质内呈点状分布,荧光表达明显增强,并且LC3-Ⅱ的蛋白表达水平明显上调;同时伴有自噬降解底物p62/SQSTM1的表达下降;此外,自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达水平明显上调.结论 EMAP-Ⅱ能明显抑制人U118胶质瘤细胞活力,诱导U118细胞发生自噬,其机制可能与自噬相关蛋白Beclin1上调有关.
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PIK3C3siRNA-pool对大鼠PC12细胞PIK3C3及P62/SQSTM1表达的影响
目的 探讨磷脂酰肌醇激酶3(PIK3C3)小干扰RNA(siRNA)-pool对大鼠PC12细胞PIK3C3及P62/SQSTM1表达的影响.方法 将处于对数生长期的PC12细胞随机分为正常组、载体组、阴性对照组及siRNA 25、50、100 nmol/L组.正常组常规培养,其余组均给予载体Lipofectamine2000转染;在转染的同时,阴性对照组加入200 pmol/L FAM-siRNA;siRNA 25、50、100 nmol/L组采用siRNA-pool法分别加入含50、100、200 nmol/L siRNA.各组转染24 h时,采用MTT法检测细胞存活率,采用RT-PCR法检测PIK3C3 mRNA相对表达量;转染48 h时,采用免疫细胞化学法检测P62/SQSTM1表达.结果 转染24 h时,正常组、载体组、阴性对照组及siRNA 25、50、100 nmol/L组细胞存活率分别为100%、(98.4±1.7)%、(99.7±2.4)%、(104.3±2.8)%、(101.6±5.1)%、(96.9±1.9)%,组间比较P均>0.05;PIK3C3 mRNA相对表达量分别为1、1.01±0.11、0.93±0.07、0.85±0.06、0.78±0.03、0.65±0.04,siRNA 50 nmol/L组PIK3C3 mRNA相对表达量均低于正常组及载体组,siRNA 100 nmol/L组均低于其他各组,组间比较P<0.05或<0.01. 正常组及siRNA 100 nmol/L组P62/SQSTM1表达光密度值分别为0.038±0.001、0.054±0.004,组间比较P<0.01.结论 PIK3C3 siRNA-pool可抑制PC12细胞PIK3C3表达,促进P62/SQSTM1蓄积.
关键词： PC12细胞 小干扰RNA 磷脂酰肌醇激酶3 p62/SQSTM1 -
发育期大鼠癫痫脑损伤中自噬相关基因的变化
目的 探讨Beclin-1、P62/SQSTM1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)和unc-51样自噬活化激酶1 (ULK-1)等自噬相关分子mRNA水平在发育期大鼠癫痫脑损伤前后的变化.方法 21日龄雄性Sprague Daw-ley(SD)大鼠72只,按随机数字表法随机分为对照组和癫痫组.每组按时间点不同(3 h、6 h、12 h和48 h)随机分4个亚组,每个亚组9只大鼠.癫痫组采用腹腔注射卡因酸(12 mg/kg)诱导癫痫发作建立癫痫动物模型,对照组予等量9 g/L盐水腹腔注射.2组大鼠分别于注射卡因酸3 h、6 h、12 h和48 h后,予水合氯醛麻醉,处死并取出脑组织.Nissl染色法检测大鼠大脑皮层神经元损伤情况;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测癫痫大鼠大脑神经元凋亡情况;实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测Beclin-1、P62/SQSTM1、LC3、ULK-1 mRNA水平.结果 Nissl染色显示:随时间推移,癫痫组大鼠大脑皮层神经元尼氏体颜色变浅,结构紊乱;癫痫48 h组Nissl染色阳性细胞数[(82 ± 8)个]明显少于对照组[(122 ± 8)个],差异有统计学意义(F＝3. 768,P＝0. 01).TUNEL方法显示癫痫48 h组大鼠大脑皮层凋亡神经元[(13 ± 7)个]明显高于对照组[(2 ± 1)个],差异有统计学意义(t ＝ -3. 821,P ＝0. 003).qPCR显示 Beclin-1、P62/SQSTM1、LC3、ULK-1 mRNA水平在癫痫组12 h组(1. 70 ± 0. 75、1. 75 ± 0. 77、1. 52 ± 0. 43、7. 48 ± 6. 12)和癫痫48 h组(1. 63 ± 0. 43、1. 48 ± 0. 74、1. 74 ± 0. 55、7. 69 ± 5. 65)均明显高于对照组(1. 00、1. 00、1. 00、1. 00),差异均有统计学意义(F＝2. 820、3. 452、5. 811、5. 002,均P＜0. 05).结论 自噬的活化先于凋亡发生,自噬相关分子可能参与发育期大鼠癫痫所致脑损伤的发病过程.
