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黑色素瘤抗原-3基因片段真核表达质粒的构建
目的构建真核重组表达质粒pcDNA-3.1-MAGE-3,为制备肿瘤核酸疫苗及探讨相关的免疫治疗提供实验依据.方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法从肝癌组织中制备出含BamHI、EcoRI酶切位点的黑色素瘤抗原-3(MAGE-3)目的基因;pGEM-T Easy为克隆载体,pcDNA3.1为真核表达载体,将目的基因分别先后定向克隆至其上;根据氨苄青霉素(Amp)抗性、蓝白筛选实验、引物T7/SP6PCR扩增方法鉴定阳性克隆,并对其中的插入序列进行DNA测序.结果成功扩增出目的基因;经鉴定得到重组质粒pGEM-T-MAGE-3和pcDNA3.1-MAGE-3;DNA测序后与GenBank中MAGE-3相应序列比较完全一致.结论成功构建pcDNA3.1-MAGE-3肿瘤核酸疫苗,可为免疫治疗提供实验依据.
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MAGE-3基因疫苗的构建及其免疫活性的实验研究
目的:构建肿瘤抗原MAGE-3基因疫苗,观察其诱导免疫应答的能力.方法:构建带有目的基因MAGE-3基因和报告基因FGFP的重组表达质粒pEGFP-MAGE3,酶切鉴定后经脂质体法转染LA795后,用G418筛选阳性克隆.在荧光显微镜下观察FGFP的表达,用RT-PCR法检测LA795中MAGE-3mRNA表达.将重组质粒pEGFP-MAGE3肌肉注射接种C57BL/6J小鼠,间隔10天,共3次,末次免疫7天后利用乳酸脱氢酶法检测脾淋巴细胞CIL杀伤活性、ELISA法脾细胞培养上清IL-2、IFN-γ浓度.结果:成功地构建了重组pEGFP-MAGE3质粒.转染LA795后,经荧光显微镜及RT-PCR分别检测到MAGE-3和EGFP的表达.杀伤实验结果显示,免疫组小鼠脾细胞对B16的杀伤率明显高于对照组(P<0.05).脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN-γ、IL-2水平明显升高.结论:成功地构建了MAGE-3基因疫苗,该疫苗能够有效地诱导特异性免疫应答,为进一步应用该基因进行免疫治疗提供了实验依据.
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MAGE-3在非小细胞肺癌中的表达及对转移、预后的影响
目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中黑色素瘤抗原-3(MAGE-3)的表达水平与NSCLC转移、预后之间的关系.方法 应用免疫组化LSAB法检测74例NSCLC和15例癌旁组织中MAGE-3的表达水平.结果 NSCLC组织中MAGE-3的表达水平均显著高于癌旁肺组织(P＜0.05).MAGE-3在肺腺癌中的表达水平显著高于肺鳞癌(P＜0.05).MAGE-3阳性组的复发、转移率高于阴性组,但P＞0.05.腺癌中不同MAGE-3表达组间复发、转移率差异有统计学意义(P＜0.05).结论 检测NSCLC中MAGE-3的表达水平有助于预测肺癌的预后,指导肺癌的多学科综合治疗.
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MAGE-3原核重组表达载体的构建和表达
目的 构建原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆菌(E.coli)BL21中的表达.方法 RT-PCR法制备MAGE-3目的基因,采用DNA重组技术将其克隆至pGEM-T Easy和亚克隆至pGEX-4T-1载体,转化E.coli BL21株,经IPTG诱导,12%SDS-PAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定.结果 扩增出349bp的MAGE-3目的基因并构建了原核重组表达载体pGEX-4T-1- MAGE-3;测序结果与GenBank收录序列相一致;在E.coli BL21中检测到含该重组表达载体的转化菌表达出分子量约35kD的融合蛋白并证实其为目的蛋白.结论 成功构建的原核重组表达载体pGEX-4T-1- MAGE-3及其所表达的融合蛋白,为以MAGE-3为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础,为后续实验提供了依据.
关键词： 逆转录-聚合酶链反应 黑色素瘤抗原-3 克隆表达 重组蛋白 -
MAGE-3目的基因原核表达载体的构建和表达
目的 构建原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆菌(E.coli)BL21中的表达,为制备以黑色素瘤抗原-3(MAGE-3)基因片段为基础的肽疫苗及特异诊断试剂提供抗原打下基础.方法 通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法制备MAGE-3目的基因,以pGEM-T Easy为克隆载体,pGEX-4T-1为原核表达载体,将MAGE-3目的基因克隆至pGEM-T Easy载体和亚克隆至pGEX-4T-1载体上.筛选、鉴定阳性克隆并将其转化E.coli BL21.经IPTG诱导,12%SDS-PAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定.结果 正确构建了原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3;在E.co1i BL21中检测到含该重组表达质粒的转化菌表达出分子量35 kD的融合蛋白;基因测序结果表明,阳性克隆中的MAGE-3目的基因序列与GenBank公布的已知序列完全一致.结论 成功构建的原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白,为以MAGE-3目的基因为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础;为后续实验提供了依据.
关键词： 逆转录-聚合酶链反应 黑色素瘤抗原-3 克隆表达 重组蛋白 肿瘤免疫 -
MAGE-3基因的表达、纯化及其抗血清的制备
[目的]构建MAGE-3的原核表达质粒,表达、纯化蛋白并制备多克隆抗体.[方法]利用RTPCR方法扩增MAGE-3基因片段,连接入原核表达载体pGEX-4T-1,构建MAGE-3的原核表达质粒pGEXMAGEE-3并测序.将该质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,并通过谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统进行分离纯化.用纯化的融合蛋白GST-MAGE-3免疫新西兰大白兔,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western-blot检测抗体活性.[结果]构建了pGEX-MAGE-3原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后表达一相对分子质量约为72×103的蛋白,经GST融合蛋白纯化系统纯化,得到了MAGE-3的重组蛋白GST-MAGE-3.制备了兔抗GST-MAGE-3抗体.Western blot证实该抗体可与GST-MAGE-3蛋白特异性结合.[结论]获得了肿瘤抗原MAGE-3的纯化重组蛋白及其特异的多克隆抗体、为进一步研究MAGE-3抗原在肿瘤免疫治疗中的作用提供了一件检测工具.
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MAGE-3基因稳定转染的HHCC细胞系的建立及其mRNA的表达
目的: 构建肿瘤抗原MAGE-3基因的真核表达载体,建立MAGE-3基因稳定转染的人肝细胞癌细胞系(human hepatocellular carcinoma cell line,HHCC).方法: 利用分子生物学方法,构建带有MAGE-3基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-3,经脂质体法转染HHCC后,用G418筛选阳性克隆.在荧光显微镜下观察HHCC中EGFP的表达,用RT-PCR法检测HHCC中MAGE-3 mRNA的表达.结果: 成功地构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-MAGE-3.以其转染HHCC后,经荧光显微镜及RT-PCR分别检测到MAGE-3 mRNA转录和EGFP的表达.结论: 建立了1株可稳定转染MAGE-3基因的肝细胞癌HHCC,为进一步应用该基因进行肝癌的免疫治疗提供了实验依据.
