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HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定
目的 构建pAdeno-EGFP-HIF-1 α重组腺病毒载体,探讨其在脊髓损伤中的作用.方法 采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法扩增目的基因HIF-1 α并亚克隆到含有报告基因EGFP的pShuttle-CMV-EGFP穿梭载体中,得到pShuttle-EGFP-HIF-1 α重组穿梭质粒.将已构建的重组穿梭质粒转移至pAdeno骨架载体上,获得pAdeno-EGFP-HIF-1 α重组腺病毒质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后进行PCR鉴定并测定病毒滴度.结果 pShuttle-EGFP-HIF-1α经KpnI/BamHI双酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组在2.5 kb和5.1 kb处出现两条带,而阴性克隆组只有5.1kb处一条带,证明pShuttle-EGFP-HIF-1 α重组穿梭质粒构建成功;pShuttle-EGFP-HIF-1 α重组穿梭质粒与pAdeno载体重组后,经XhoI单酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组出现14.5 kb,11.7 kb,2.66 kb,2.6 kb,2.48 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb八条带,而阴性克隆的腺病毒空载组有14 kb,11.8 kb,4.0 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb六条带,证明重组pAdeno-EGFP-HIF1α腺病毒质粒构建成功;pAdeno-EGFP-HIF-1 α重组腺病毒成功包装纯化后经PCR鉴定,实验组和阳性对照组中均扩增到2.5 kb片段,证明目的病毒中成功整合了HIF-1 α基因;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×1010 PUF/ml.结论 成功构建了HIF-lα和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体,为进一步研究其在脊髓损伤中的作用奠定了基础.
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低氧诱导因子-1α和角质细胞生长因子双基因重组减毒沙门菌菌株的构建及其在肠上皮细胞中的表达
目的 构建同时携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和角质细胞生长因子(KGF)真核表达载体的减毒沙门菌菌株(Ty21a-pIRES-HIF-IRES-KGF,TPHK),观察其在防治肠黏膜损伤方面潜在的应用前景.方法 采用RT-PCR法从低氧处理A549细胞扩增HIF-1α cDNA后连接到载体pIRES-SEQ的NheI和MluI酶切位点,构建单基因重组质粒pIRES-HIF.然后以质粒pIRES2-EGFP-KGF为模板扩增KGF基因并克隆到重组质粒pIRES-HIF的XbaI 和NotI酶切位点上,获得双基因重组质粒pIRES-HIF-IRES-KGF.采用电穿孔法将pIRES-HIF-IRES-KGF质粒转入减毒沙门菌Ty21a中,通过筛选获得TPHK.该菌株转染肠上皮细胞IEC-6后48 h,用ELISA法检测上清中HIF1α和KGF的表达水平.并采用MTT方法分析不同剂量表达产物对IEC-6细胞的作用.结果 通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实TPHK构建成功.TPHK转染正常肠上皮细胞IEC-6后,48 h取上清用ELISA法检测HIF和KGF的表达,结果表明6×105个细胞可表达(16.03±1.47)ng的HIF蛋白和(17.77±1.83)ng的KGF蛋白.MTT结果表明表达上清有明显刺激正常肠上皮细胞IEC-6增殖的活性(P＜0.05),加入20%表达上清时刺激活性达高峰.结论 成功构建了TPHK,其可有效转染肠上皮细胞IEC-6,表达上清可显著促进IEC-6细胞增殖.提示TPHK具有潜在的在肠黏膜损伤局部应用的前景.
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HIF-lα、VEGF在移植肝肝内胆管上皮细胞的表达及其意义
目的:低氧预适应可使重要脏器对缺血缺氧产生耐受,是一种内源性保护现象.文中探讨低氧诱导因子-lα(HIF-lα)和血管内皮生长因子(VEGF)在移植肝肝内胆管上皮细胞的表达情况及引起移植肝胆管并发症的因素.方法:建立大鼠自体肝移植模型,AT组为自体肝移植,HP组为低氧预适应后行自体肝移植,并设正常对照组.于术后6、12、24、48h取材,光镜下观察胆管上皮细胞的病理变化,免疫组织化学法检测各组胆管上皮细胞HIF-lα、VEGF的表达情况. 结果:光镜下与HP组相比,AT组胆管上皮细胞损伤严重,细胞排列缺失明显,炎性细胞浸润增加;各组胆管上皮细胞均有HIF-lα、VEGF的表达,其中HP组表达强. 结论:HIF-lα、VEGF可能参与了低氧预适应对移植肝肝内胆管上皮细胞的保护作用.
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低氧诱导因子-1α和p53蛋白在宫颈癌中的表达
目的 探讨低氧诱导因子-1α和p53蛋白在宫颈癌、宫颈上皮内瘤样变及正常宫颈组织中的表达及意义.方法 采用免疫组化SP法检测低氧诱导因子-1α和p53蛋白在54例官颈癌、28例宫颈上皮内瘤样变和20例正常宫颈组织中的表达情况.结果 ①低氧诱导因子-1α和p53蛋白在宫颈癌中强阳性表达、宫颈上皮内瘤样变中少量表达、正常宫颈组织中无表达,三者之间有显著性差异(X2=25.974,P<0.01);②低氧诱导因子-1α在宫颈上皮内瘤样变Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中阳性表达呈上升趋势,但无显著性差异(X2=1.179,P>0.05),p53蛋白在宫颈上皮内瘤样变Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中表达无显著性差异(X2=1.426,P>0.05);③低氧诱导因子-1α表达与宫颈癌临床分期显著相关(X2=7.488,P<0.05),与分化程度显著相关(X2=8.589,P<0.05),与淋巴结转移显著相关(X2=12.295,P<0.05),并且与肿瘤恶性程度成正相关(r=0.370,P<0.05),p53蛋白表达与宫颈癌临床分期显著相关(X2=6.888,P<0.05);④低氧诱导因子-1α与p53蛋白在宫颈癌组织中阳性表达呈正相关(r=0.339,P<0.01).结论 低氧诱导因子-1α和p53蛋白过度表达,在宫颈癌的发生、发展过程中具有重要作用,是宫颈癌发生的早期事件,其表达水平随着宫颈癌恶性程度的增加而增加,且低氧诱导因子-1α与宫颈癌的发展和转移有关;突变型p53蛋白表达增加的同时低氧诱导因子-1α表达增加,二者具有正相关性,联合检测可作为判定肿瘤恶性程度、预测转移和评估预后的指标.
