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miR-217靶向调控胰岛素分泌细胞诱导分化NeuroD1基因表达
目的：实现骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells，IPCs)的诱导分化并验证分化过程中miR-217靶向调控NeuroD1基因表达。方法分离培养BMSCs，应用大鼠胰腺损伤提取物(rat pancreatic extraction，RPE)将其诱导分化为IPCs。采用靶基因预测软件miRanda和TargetScan对miR-217和NeuroD1基因的靶向匹配关系进行预测并通过双荧光素酶报告基因系统鉴定。qRT-PCR检测诱导分化过程中miR-217和NeuroD1的表达。结果诱导分化后的细胞双硫腙染色呈猩红色，免疫荧光化学显示有胰岛素表达。生物信息学方法预测发现miR-217和NeuroD1基因二者匹配良好，通过双荧光素酶报告基因系统检测发现miR-217能结合到NeuroD1 mRNA的3'UTR并有效抑制其表达。qRT-PCR检测结果表明，miR-217的表达水平与NeuroD1表达呈负相关。结论 miR-217能调控IPCs诱导分化过程中NeuroD1的表达。
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2型糖尿病NEUROD1基因的研究
47例2型糖尿病(均40岁以后发病)家系先证者PCR-SSCP检测出两种NEUROD1基因变异;Ala45Thr和Ile156Ile.122例40岁以后发病的2型糖尿病患者和132例正常对照Ala45Thr基因型和基因频率分布差异无显著性,提示NEUROD1基因Ala45Thr突变不是中国人2型糖尿病的重要遗传因素.
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MiRNA-24、 miRNA-34 a和miRNA-375抑制小鼠胰岛β细胞系MIN6细胞中Neurod1／BETA2的蛋白表达
目的：在小鼠胰岛β细胞系MIN6细胞中分析miRNA?24、 miRNA?34a和miRNA?375对Neurod1／BETA2的表达调控以及作用方式。方法设计并合成针对小鼠Neurod1基因3′非翻译区（3′untranslated re?gion，3′UTR）序列的引物，克隆于pMIR?REPORTTM荧光素酶报告基因载体中；用miRanda软件预测可能调控Neurod1表达的miRNAs，挑选在β细胞中有相关功能研究的miRNAs并委托公司合成pre?miRNAs；脂质体法转染至MIN6细胞中，荧光素酶报告基因技术分析这些miRNA对Neurod1的作用；定量RT?PCR分析Neurod1的mRNA水平； Western 印迹检测Neurod1的蛋白表达水平； GSIS检测干扰Neurod1后MIN6细胞的功能。结果成功制备小鼠Neurod1基因的3′UTR荧光素酶报告基因载体；选取了预测在Neurod1的3′UTR有互补结合位点的3个miRNAs （miRNA?24、 miR?34a和miR?375），并挑选一个没有互补结合位点的miRNA （miR?29a）作为阴性对照；在MIN6细胞中过表达pre?miRNA?24、 pre?miR?34a和pre?miR?375能够抑制Neurod1基因3′UTR荧光素酶报告基因的活性，而过表达阴性对照 miRNA?29a则不能抑制其活性；pre?miRNA?24、 pre?miR?34a和pre?miR?375还可以不同程度抑制Neurod1的蛋白表达；在MIN6细胞中干扰Neurod1蛋白表达能够降低细胞的GSIS功能。结论 miRNA?24、 miR?34a和miR?375能够抑制小鼠胰岛β细胞系MIN6细胞中Neurod1的蛋白表达。
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过表达NeuroD1对脊髓反应性星形胶质细胞转分化为神经元的影响
目的：探讨过表达NeuroD1对脊髓反应性星形胶质细胞转分化为神经元的影响。方法体外原代培养SD大鼠脊髓星形胶质细胞，以划痕实验制备反应性星形胶质细胞。实验分为空白组（NV组）、对照病毒组（GFP组）和NeuroD1病毒组（NeuroD1组）。各组行划痕处理7 d后，NV组不感染病毒，GFP组感染携带GFP基因的逆转录病毒，NeuroD1组感染同时携带GFP和NeuroD1基因的逆转录病毒，24 h后同时更换神经元条件培养基。各组在1d、2d、3d、5d、7d、14d观察细胞形态，并采用免疫荧光染色方法分别在感染病毒后7d观察细胞DCX阳性率和14 d观察细胞NeuN阳性率。结果更换神经元条件培养基后，各组细胞形态发生改变，胞核明显饱满，胞浆减少，突起减少并延长。与NeuroD1组相比，NV组和GFP组细胞突起短而分枝多，胞核较小。感染病毒后7 d，NV组和GFP组细胞部分形态逐渐恢复以前形态而NeuroD1组维持变化后形态。与NV组和GFP组相比，NeuroD1组出现DCX（9.84%±2.06%）(F=40.107)和NeuN（8.25%±2.78%）阳性细胞(F=21.73)，结果差异都有统计学意义（P<0.05）。结论在体外培养，NeuroD1的过表达可以介导体外培养脊髓反应性星形胶质细胞转分化为神经元。
